Lateral Flow Immunoassay for Naked Eye Detection of Mycobacterium tuberculosis
admin - juli 25, 2021Abstract
Tuberkulos (TB) är en infektionssjukdom som orsakas av Mycobacterium tuberculosis. Upptäckt och kontroll av infektionssjukdomar är ett stort problem, särskilt i utvecklingsländer. Lateral flow immunoassay (LFIA) har introducerats som en handhållen immunoassaybaserad point-of-care-plattform för en automatiserad detektion av tuberkulos. CFP10-ESAT6-antigenet från M. tuberculosis användes som mål för tidig upptäckt av tuberkulos med hjälp av LFIA-bandbaserad POC-strategi. En intressant plattform baserad på optiska signaler implementeras som en färgförändring i detektionsområdet som är synlig för blotta ögat. Guldnanopartiklar (AuNPs) användes som färgsonder för att upptäcka ett intressant mål. Den högupplösta bilden från transmissionselektronmikroskopet (HRTEM) och analysen med ultraviolett-siktlig spektrofotometer (UV-Vis) bekräftade att de syntetiserade AuNP:erna var lämpliga för det utformade immunoassayet. Plattformen består av AuNPs som är konjugerade med specifika antikroppar (Ab) för att fånga upp antigenet från M. tuberculosis. Under kapilläreffekten utfördes sandwichimmunreaktioner av AuNP-Ab-antigen på testplattan i immunostrippen, vilket kan observeras genom färgsignalen på testlinjen i strippen med en kort testtid. Dessutom användes den nyutvecklade biosensorn för detektion av CFP10-ESAT6-antigen i mänskliga sputumprover med tillfredsställande resultat. De karakteristiska färgade banden möjliggör visuell detektion (med blotta ögat) av målanalyten utan instrumentering. Detta icke-invasiva diagnossystem som är sputumbaserad kan ge användarvänliga och prisvärda diagnostiska tester i utvecklingsländer.
1. Introduktion
Tuberkulos (TB) är en av de dödligaste infektionssjukdomarna som blivit ett betydande folkhälsoproblem i hela världen . Sjukdomen orsakas huvudsakligen av infektion av Mycobacterium tuberculosis, som kan överföras via små aerosoldroppar, t.ex. vid hosta, nysningar eller till och med genom att en smittad tuberkulosperson pratar. Denna luftburna smittsamma sjukdom orsakar mer än nio miljoner nya fall per år, vilket gör tuberkulos till den näst vanligaste dödsorsaken efter infektion med humant immunbristvirus (HIV) . De främsta orsakerna till den höga förekomsten av tuberkulos är otillräcklig tillgång till effektiva diagnostiska metoder och oförmåga att behandla alla smittsamma fall av lungtuberkulos i tid, vilket möjliggör fortsatt överföring av M. tuberculosis inom samhällen.
Den nuvarande guldstandarden för tuberkulosdiagnostik är mikroskopi av sputumutstryk, röntgenundersökning av bröstkorgen och fast odling . Även om metoderna kan diagnostisera tuberkulos är dessa tester begränsade av dålig känslighet, låg specificitet och en tidskrävande process . Nukleinsyraamplifieringsbaserade system har utvecklats och erbjuder relativa förbättringar när det gäller känslighet, specificitet och snabb upptäckt av M. tuberculosis jämfört med konventionella tekniker. Denna metod kräver dock hög teknisk kompetens och dyr utrustning och används endast i skickliga laboratorier som har råd med referensreagenser för att övervaka testets prestanda . Eftersom tuberkulos är en fattigdomsdrabbad sjukdom, där över 90 % av den globala tuberkulosbördan sker i låg- och medelinkomstländer, finns det ett otillfredsställt behov av tillförlitliga diagnostiska metoder för att identifiera tuberkulos snabbt, effektivt och exakt på ett ekonomiskt sätt som kan användas i resurssvaga miljöer.
Pappersbaserade immunoassays representerar en kraftfull teknik med hög relevans inom biosensing eftersom den uppnådde de krav som krävs för point-of-care (POC) enheter, inklusive snabb detektion, en liten mängd prov och låg kostnad så att fler människor bekvämt kan få kostnadseffektiv sjukvård i resursbegränsade områden . Pappersbaserade POC-immunoassays består i allmänhet av tre huvudkomponenter, dvs. papper som substrat, antikroppar som detektionselement och reportermolekyler som signalomvandlande element. Lateral flow immunoassay (LFIA), även känd som strip-based biosensing, är en av de befintliga pappersbaserade plattformarna som utgör den mest gynnsamma strategin för analyser på plats och för engångsanalyser med engångssensor . Det är värt att nämna att elektrokemiska metoder också drar nytta av laterala flödesremsor . LFIA har dock vissa nackdelar; till exempel kan denna teknik vid låga koncentrationer av analyter innebära problem när det gäller känslighet .
Inkorporering av nanopartiklar (NP), t.ex. guldnanopartiklar (AuNPs), med olika biokänslighetselement (antikroppar, peptidarrayer, polymerer och aptamerer) är en effektiv strategi för att förbättra detektionssystemens prestanda. Den AuNP-baserade pappersbiosensorn har nyligen varit föremål för intensiva studier för att diagnostisera olika infektionssjukdomar, t.ex. malaria, hepatit B-virus (HBV), denguefeber, ebolavirus (EBOV) och andra virus. I detta sammanhang har tre typer av pappersbaserade immunoassays demonstrerats, inklusive kolorimetriska, fluorescensbaserade och elektrokemiska immunoassays. Även om de fluorescensbaserade och elektrokemiskt baserade immunoanalyserna uppvisar avancerade förtjänster när det gäller känslighet, har de också problem med flera steg och läsarberoende vid detektion, vilket gör dem mindre bekväma för slutanvändarna. Fördelarna med kolorimetriska immunoassays är låg kostnad, utrustningsfri, snabb, läsbar med blotta ögat och lämplig för screening med hög genomströmning på plats. Förbättringar av noggrannhet, känslighet och kvantifiering är dock fortfarande en utmaning.
När det gäller handhållna detektionsplattformar för POC, särskilt för tuberkulosdetektering, tycks kolorimetrisk-baserad LFIA vara en bra början, eftersom denna metod möjliggör snabb diagnostik på fältet och är enkel att använda. Dessutom är tidig upptäckt så viktig för att möjliggöra att tuberkulosbehandling inleds i tid, vilket är nyckeln till att minska dödligheten och undvika tuberkulosepidemier. För att uppnå detta har vi fokuserat på M. tuberculosis sekretoriska proteiner som lämpar sig för tidig upptäckt av tuberkulos. Det 10 kDa stora kulturfiltratproteinet (CFP10) och det 6 kDa stora tidiga sekretade antigenmålet (ESAT6) visade sig kodas av generna Rv3874 respektive Rv3875. Dessa gener är belägna i regionen för skillnad-1 (RD-1) i det virulenta M. tuberculosis-genomet, som är potenta T-cellsantigen som känns igen hos över 70 % av tuberkulospatienterna . En spännande upptäckt var att ESAT6 och dess proteinpartner, CFP10, binder tätt till varandra i förhållandet 1:1 genom hydrofoba och Van der Waals-interaktioner för att bilda ett ESAT6-CFP10-proteinkomplex. Båda proteinerna antar en stabil, fullt veckad struktur i komplexet, med ungefär två tredjedelar av ryggraden i en regelbunden spiralformad konformation . Meher och medarbetare rapporterade att komplexbildningen av ESAT6-CFP10 resulterade i strukturella förändringar, förbättrad termodynamik och biokemisk stabilitet samt förlust av bindning till fosfolipidmembran . Detta tyder på att ESAT6 och CFP10 är aktiva som ett komplex och kan ge flera funktionella fördelar, bland annat en bättre kontroll av aktiviteten hos reglerande proteiner, t.ex. transkriptionsfaktorer, och en allmän mekanism för att öka specificiteten hos protein-protein- och protein-nukleinsyrainteraktioner . Dessutom visade det arbete som rapporterades av Renshaw och medarbetare att kombinationen av CFP10-ESAT6-antigenet ökade testets diagnostiska prestanda jämfört med ett enskilt antigen .
Här i detta arbete kombinerades fördelarna med LFIA och CFP10-ESAT6 som identifieringsproteinbiomarkör, och för första gången utvecklade vi en immunoassaybaserad testremsa för engångsbruk som en ny biosensor för snabb detektion av tuberkulos med hjälp av blotta ögat. Det är värt att notera att strategin där AuNPs införlivas som märkning spelar en avgörande roll för att förbättra den visuella effekten och responsintensiteten hos LFIA. Utformningen och responsprincipen för denna nyutvecklade metod illustreras i figur 1. Antikroppar är bundna på olika positioner på LFIA för att fånga upp målantigen, och de färgade detektorreagenserna som är märkta (AuNPs) på antikropparna ger de färgade svaren på testzonen och kontrollzonen på LFIA. De karakteristiska färgade banden möjliggör visuell detektion (med blotta ögat) av målanalyten. Ett sandwich-immunoassay-format användes för att förstärka detektionssignalen och öka sensorns selektivitet mot TB-specifika biomarkörer. Om både en färgad testlinje och en färgad kontrolllinje uppträder, indikerar detta ett positivt resultat (figur 1 a), medan en enda färgad kontrolllinje indikerar ett negativt resultat (figur 1 b). Kontrolllinjen visar att provet har migrerat över membranet på avsett sätt, oavsett om analyten finns i provet eller inte. Om inga färgade linjer visas alls anses det vara ett ogiltigt resultat och testet måste därför upprepas.
(a)
(b)
(a)
(b)
Vi har också visat att den utvecklade LFIA är effektiv för detektion av CFP10-ESAT6 i sputum, insamlat från mänskliga prover från tuberkulosinfekterade personer. Studien föreslog att den blodtestfria metoden genom sputumdetektion av biomarkörer kan vara av värde vid tidig upptäckt av tuberkulossjukdom, särskilt i HIV-positiva fall, och därmed skulle kunna ge breda potentiella tillämpningar i klinisk analys och användning i hemmet utan perifert laboratorieimplementering.
2. Material och metoder
2.1. Material och reagenser
Polyklonala anti-CFP10-antikroppar, kanin mot M. tuberculosis, kanin mot M. tuberculosis HRP-konjugat, get anti-rabbit IgG-antikroppar, M. tuberculosis ESAT-6-liknande protein esxB (CFP-10) och rekombinant M. tuberculosis immunogena protein MPT64-antigen köptes från Cusabio (Selangor, Malaysia). Bovint serumalbumin (BSA), humant serum, guld(III)kloridtrihydrat, kaliumkarbonat, fosfatbuffrade saltlösningstabletter (PBS) och Tween-20 köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 3,30,5,50-Tetrametylbenzidin (TMB) ELISA-substrat och natriumcitrat erhölls från Abcam (Cambridge, Storbritannien) respektive R&M Chemicals (Essex, Storbritannien). Sputumprover från patienter från Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM), Kelantan, Malaysia, användes med identifieringsnummer TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280 och SA217. För sputumprovet avstod man från kravet på samtycke eftersom sputumprovet endast är överblivna prover som har använts för laboratorieändamål av HUSM. Dessutom godkändes det protokoll som användes i denna studie av den medicinska forsknings- och etikkommittén (MREC) vid hälsovårdsministeriet i Malaysia (godkännandenummer: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).
2.2. Syntes av guldnanopartiklar
Guldnanopartiklarna (AuNPs) syntetiserades genom citratreduktionsmetoden som tidigare rapporterats . En guldkloridlösning framställdes genom att lösa upp guldklorid i 100 ml avjoniserat vatten, och den framställda lösningen förvarades skyddad från ljus. Därefter bereddes en natriumcitratlösning före användning genom att lösa natriumcitrat i 100 ml avjoniserat vatten och filtreras. Guldkloridlösningen värmdes tills lösningen kokade och natriumcitratet tillsattes klokt droppe för droppe. Efter 10 minuter placerades kolven i ett vattenbad för att svalna i minst 15 minuter. De resulterande AuNPs samlades sedan upp och förvarades i ett kylskåp vid 4 °C tills de används vidare. De syntetiserade AuNPs karaktäriserades sedan med hjälp av UV-Vis- och HRTEM-bilder.
2.3. Konjugering av kaninanti-M. tuberculosis-antikropp med AuNPs
Konjugering av kaninanti-M. tuberculosis-antikropp med AuNPs framställdes enligt de metoder som tidigare beskrivits med en liten modifiering. I korthet tillsattes 6 μl kaninantikropp mot M. tuberculosis (12 μg/ml) till 5 ml kolloidal guldlösning. Före användning justerades pH-värdet för den beredda AuNP-lösningen till 8,0 med hjälp av 0,2 M kaliumkarbonat och 0,1 M HCl. Blandningen rördes i 10 minuter och 10 % bovint serumalbumin tillsattes. Blandningen inkuberades i 30 minuter och förvarades över natten i 4 °C. Därefter centrifugerades blandningen i 10 minuter vid 11 000 g för att avlägsna okonjugerade antikroppar. Pelleten återuppsattes med passiv spädningsbuffert (PDB) motsvarande 1/10 av den ursprungliga volymen. Den optiska densiteten (OD) studerades med hjälp av UV-Vis vid 540 nm för att få . Slutligen filtrerades den konjugerade antikroppslösningen med AuNP-lösningen genom ett 0,45 μm cellulosaacetatfilter.
2.4. Spotting av testlinje och kontrolllinje på nitrocellulosmembran
Rabbit IgG-antikropp dispenserades på nitrocellulosmembran som kontrolllinje i en koncentration på 1 mg/ml. Kanin-antikropp mot M. tuberculosis i en koncentration av 1 mg/ml spottades på ett nitrocellulosemembran som testlinje. Antikroppen var beredd i PBS-buffert och 1 % sackaros. Nitrocellulosmembranet torkades vid rumstemperatur och förvarades vid 4 °C.
2.5. Lateral Flow Immunoassay Strips
LFIA-remsor köptes från Kestrel Bio Sciences (Thailand) Co., Ltd. LFIA-konstruktionen visas i figur 2. LFIA-remsan är utformad med tre överlappande kuddar som är placerade på ett stödkort: provkudde (Millipore C048, ), membran (Whatman FF 60/100, ) och vickkudde (Whatman 470, ). LFIA-remsorna monterades på underlagskortet i tur och ordning med 1-2 mm överlappning. Kaninantikroppen mot M. tuberculosis konjugerad med AuNP-lösning med immobiliserades på en konjugatkudde (0,5 μl per 1 mm). Konjugatkudden torkades vid 37 °C i 1 timme. Därefter lades get-antikantikroppar mot kanin-IgG och kanin-antikroppar mot M. tuberculosis på nitrocellulosamembranet för att bilda kontroll- respektive testlinjen. Membranen torkades i rumstemperatur över natten. Slutligen klipptes LFIA-remsorna till 4 mm breda remsor och förvarades vid 4 °C tills de användes.
Sputumproverna späddes ut med lysisbuffert, och 100 μl av det förberedda provet applicerades på provplattan. De förberedda remsorna placerades horisontellt i 5-10 minuter för att låta provet flöda från provplattan till våmplattan. Rödaktig färg vid testlinjen och kontrolllinjen observerades.
2.6. Konventionellt ELISA-test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
För att bekräfta positivitet och negativitet hos proverna i jämförelse med vårt utvecklade LFIA-test gjordes ett semikvantitativt ELISA-test. För detta ändamål belades ELISA 96-hålsplattor med 100 μl kaninantikropp mot M. tuberculosis med en koncentration på 1 μg/ml i karbonatbuffert. ELISA-plattan täcktes med parafilm och inkuberades i 2 timmar. Därefter tvättades varje belagd brunn tre gånger genom att brunnarna fylldes med tvättbuffert innehållande PBS och Tween-20. Alla lösningar avlägsnades genom att vända plattan 2-3 gånger för att avlägsna eventuellt obundet protein. Efter tvättsteget blockerades ELISA-plattan genom att tillsätta 250 μl blockeringsbuffert (PBS och BSA) i 30 minuter i rumstemperatur. ELISA-plattan tvättades igen tre gånger med tvättbuffert och 100 μl av olika koncentrationer av CFP10-ESAT6-antigenet från M. tuberculosis i antikroppsspädningsbuffert innehållande PBS, Tween-20 och BSA tillsattes i varje brunn. Alla antigener testades i tre exemplar och inkuberades över natten vid 4 °C. Efter inkuberingen av antigenet tvättades plattan igen tre gånger med hjälp av tvättbuffert och 100 μl kaninanti-M. tuberculosis HRP-konjugat tillsattes i varje brunn under en timme, följt av tvättsteget och tillsats av TMB-substratlösning. Blå färg kommer att uppstå, vilket indikerar närvaron av märkta detektionsantikroppar med komplement antikropp-antigenbindning. Slutligen tillsattes 100 μl stopplösning (0,5 M H2SO4) och absorbansen avlästes med hjälp av en ELISA-mikroplattläsare.
3. Resultat och diskussion
3.1. Validering av sandwichformatet med hjälp av konventionellt ELISA-förfarande
För att ytterligare förklara sandwichstrategins sensormekanism och utvärdera de specifika rollerna hos de använda antikropparna genomfördes kontrollexperiment. ELISA-analys användes för att verifiera bindningen av antikropp och antigen på testlinjen enligt figur 3.
(a)
(b)
(a)
(b)
Detektionsantikroppen var märkt med HRP-enzym som ger en färgad signal när TMB tillsätts. ELISA-sandwichkomplexet bildades, vilket innefattar fångstantikroppen, antigenet och detektionsantikroppen (figur 3(a)). Som framgår av figur 3 a visar kontrollbrunnen ingen färgsignal eftersom frånvaron av antigen inte orsakar någon bindning av den märkta detektionsantikroppen. ELISA-plattan visar den blå signalen i brunnarna med antigen och ingen blå signal kan observeras i avsaknad av antigen. Resultaten bekräftade att fusionsproteinet CFP10-ESAT6 har varit ett utmärkt kandidatantigen med hög specificitet för de utvalda antikroppar som användes i detta arbete baserat på immunodiagnostikens sandwichformat i ELISA.
Även om ELISA visar sig vara en effektiv metod för bestämning av CFP10-ESAT6 i M. tuberculosis, kan de omständliga tvättprocedurerna och den nödvändiga antikroppsmärkningen begränsa den breda användningen av denna metod för enkel och snabb detektion av TB. I denna studie etablerade vi därför en enkel, bärbar, användarvänlig och snabb plattform för bestämning av anti-CFP10-ESAT6-antikroppar för tuberkulosdiagnostik baserad på LFIA i sandwich-analysformat, som visas i figur 3(b). Användningen av AuNPs möjliggör rödaktig färgobservation. Ett positivt resultat indikerar genom observation både en färgad testlinje och en färgad kontrolllinje, medan en observation av en enda färgad kontrolllinje indikerar ett negativt resultat. Den nuvarande laterala flödesanordningen är lovande för användning i tillämpningar där AuNPs fäster genom specifika biologiska igenkänningshändelser (målbindande konfiguration) när målanalyten (CFP10-ESAT6) är närvarande.
3.2. Karaktärisering av antikroppar konjugerade med guldnanopartiklar
De syntetiserade AuNPs karaktäriserades med hjälp av UV-Vis och HRTEM för att få fram våglängden för den maximala absorbansen () respektive för att bestämma morfologin hos AuNPs som syntetiserats med citratreduktionsmetoden. Baserat på figur 4(a) absorberar partikeln av AuNPs ljus vid en absorbans på 520 nm på grund av ytplasmonresonansen. HRTEM-bilden i figur 4(b) visar en tydlig bild av sfäriska AuNPs som är mindre aggregerade med varandra, och den genomsnittliga storleken på de erhållna AuNPs är ungefär ~30 nm enligt figur 4(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
AuNP-märkningsmetoden användes som en snabb detektion av M. tuberculosis med hjälp av laterala flödesremsor. AuNPs som var konjugerade med kaninantikropp mot M. tuberculosis optimerades för att få en stabil rubinröd färg för utseende som signal i testlinjen och kontrolllinjen. Guldkolloidens stabilitet undersöktes utifrån kolloidens absorption efter tillsats av olika koncentrationer av antikroppar. Den optimala stabiliserande antikroppskoncentrationen fastställdes genom att använda olika koncentrationer av antikroppar. För konjugering fästs antikropparna vid AuNP-ytan genom fysiska och kemiska interaktioner . Antikroppen adsorberas ospecifikt på AuNPs medan stabiliteten i kolloidal lösning åstadkoms av de negativt laddade nanopartiklarna . Guldkolloidens stabilitet undersöktes utifrån kolloidens absorption efter tillsats av olika koncentrationer av antikroppar.
Figur 5(a) visar färgförändringarna i AuNP-lösning som innehåller antikroppar med olika koncentrationer. Lösningens färg ändrades från rött till blått efter tillsats av en låg koncentration av antikropp från kanin mot M. tuberculosis i närvaro av NaCl. Den röda färgen hos AuNPs förblir i ett stabilt tillstånd när en hög koncentration eller överskott av antikroppar tillsattes. Den lägsta koncentrationen av antikroppar för att stabilisera det kolloidala guldet var cirka 10 μg/ml, vilket visas i figur 5 b. Vid 10 μg antikropp per 1 ml guldlösning var antikroppen tillräckligt bunden till AuNPs. Mer protein bands till AuNPs när koncentrationen av antikroppen ökade, där alla tillgängliga bindningsställen var upptagna. Figur 5(c) visar UV-Vis-absorptionsspektra för olika koncentrationer av antikroppar konjugerade med AuNP-lösning. Den maximala SPR-absorptionen för lösningarna 1 till 8 (från antikroppar med hög koncentration) visas ungefär vid 550 nm, medan lösningarna 9 till 11 (antikroppar med lägre koncentration) visar en lång våglängdsförskjutning vid 570 nm. Detta beror på den aggregering av AuNP som visas i lösningarna 9-11.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. Karaktärisering av lateralflödesimmunoassay för detektion av tuberkulos med antigen och antikroppar
Testremsor konstruerades enligt figur 6. Det finns tre huvuddelar i en remsa: en konjugatkudde, ett membran och en absorberande kudde. Whatman-membran användes för att flödet av provet skulle gå smidigt. Provet från provplattan kommer att flöda genom den konjugerade plattan fram till den absorberande plattan. Den absorberande plattan drog provet över test- och kontrolllinjerna genom att fånga upp det överflödiga provet. Antikroppen konjugerad med AuNPs deponerades på konjugatplattan. Kaninen mot M. tuberculosis riktades in på membranet som var känt för att vara testlinjen. Den andra linjen var inriktad på get-antikropp mot kanin-IgG och känd som kontrollinje. Antikroppen på testlinjen kommer att fånga upp det antigen som var bundet till antikroppen märkt med AuNPs. Som ett resultat av detta kunde en rödaktig signalfärg observeras på testlinjen. Kanin-IgG-antikroppen på kontrolllinjen fångar upp den återstående AuNP-märkta antikroppen och kan alltid visa signal som ett valideringstest.
(a)
(b)
(a)
(b)
Kontrolllinjen på nitrocellulosemembranet optimerades så att en tydlig rödaktig signal kunde observeras med blotta ögat. Testremsorna testades med lysisbuffert (inget antigen), och bufferten lät man flöda lateralt på nitrocellulosemembranet. Den rödaktiga signalen på kontrollsträngen kan observeras enligt figur 6 a med blotta ögat efter 5-10 min buffertladdning. Efter att ha testat de laterala flödesremsorna med ett kliniskt prov från patienter med positiv tuberkulos, fördelades 100 μl lösning på provplattan. Som framgår av figur 6 b kunde en rödaktig signal observeras på testlinjen och kontrolllinjen. Detta resultat tyder på att antikroppen på testlinjen framgångsrikt bundits till CFP10-ESAT6-antigenet i sputumprovet.
Den utvecklade LFIA testades ytterligare med olika typer av antigener för att verifiera remsornas specificitet. Testlinjen på varje remsa som har prickats av med antikroppen observerades efter 5-10 minuter efter det att varje mål flödar från provplattan till vickplattan. Som framgår av figur 7 syntes signalen på remsans testlinje när sputumprovet laddades efter 10 minuter. Samtidigt observerades ingen signal på kontrollremsans testlinje, vilket tyder på att det inte finns något mål i provet. Resultaten visar antikroppens specifika mål på testlinjen när ingen signal kunde ses på testlinjen när det rekombinanta M. tuberculosis immunogena proteinet MPT64-antigenet och humant serumalbumin testades på remsorna. Därför upptäcker den utvecklade LFIA specifikt sputumprovet som innehåller CFP10-ESAT6 och antikroppen på testlinjen fångar endast provets specifika mål.
3.4. Reproducerbarhetsstudie
Reproducerbarhetsstudien av de utvecklade LFIA-remsorna tillämpades genom att förbereda tre remsor från samma sats för varje patient med kliniskt sputumprov. Baserat på figur 8 testades varje sputumprov från olika tuberkulospositiva patienter (1-5) och tuberkulosnegativa patienter (6) på LFIA-remsor och resultaten observerades efter att sputumproverna laddats på provplattan. Resultaten på varje remsa visar att både testlinjen och kontrolllinjen visar signal efter 5-10 minuter. CFP10-ESAT6-antigenet från M. tuberculosis från det kliniska sputumprovet från tuberkulospatienter upptäcktes alltså av antikroppen på varje testlinje på remsorna. Dessa resultat tyder på att precisionen för varje remsa bedömdes genom att slumpmässigt välja LFIA för detektion av analyten i provet. För att ytterligare verifiera att färgförändringen beror på att den komplementära målantikroppen fäster vid fångstantikroppen på den utvecklade LFIA-remsan användes ytterligare ett test med hjälp av sputumprovet från en tuberkulosnegativ patient (patient 6). Efter att ha laddat provet på provplattan i 5-10 minuter visade testet ingen signifikant färgförändring vid testlinjen jämfört med kontrolllinjen, vilket tyder på avsaknad av ospecifik bindning av målantigenet till fångstantikroppen på testlinjen. Detta bevisar att färgdetektion sker genom att komplementärt målantigen från M. tuberculosis binds till en antikropp som är funktionaliserad på den utvecklade LFIA-remsan.
(a)
(b)
(c)
.
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Slutsatser
Vi demonstrerade en snabb, enkel och prisvärd metod baserad på LFIA för ultrasensitivt system för detektion av tuberkulos med blotta ögat. CFP10-ESAT6-detektering med hjälp av sandwichformatförfarandet som presenteras i denna nyutvecklade immunosensor visar på en enkel och lätt plattform som kan utgöra en snabb alternativ strategi med potential att användas vid tuberkulosdiagnostik i jämförelse med ELISA-metoden. Det utvecklade sandwichimmunoassayet visade ett exceptionellt detektionssvar för CFP10-ESAT6 i sputumprover för kliniska prover och uppvisade hög känslighet, specificitet och reproducerbarhet som en engångssensor. Detta bandbaserade immunoassay skulle kunna ge stor potential i lågkostnads- och POC-applikation för tuberkulosdiagnostik.
Datatillgänglighet
Data som används för att stödja resultaten i denna studie ingår i artikeln.
Interessentkonflikter
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Malaysias ministerium för högre utbildning och Universiti Putra Malaysia för det ekonomiska stödet genom Malaysia Research University Network (MRUN)-Universiti Putra Malaysia (UPM) (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230). Ett särskilt tack går också till Siti Suraiya från HUSM Kubang Kerian, Kelantan, för att hon hjälpte till med testning av riktiga prover.
Lämna ett svar