Lateral Flow Immunoassay for Naked Eye Detection of Mycobacterium tuberculosis
admin - iulie 25, 2021Abstract
Tuberculoza (TB) este o boală infecțioasă cauzată de Mycobacterium tuberculosis. Detectarea și controlul bolilor infecțioase reprezintă o problemă majoră, în special în țările în curs de dezvoltare. Imunodozarea cu flux lateral (LFIA) a fost introdusă ca o platformă portabilă bazată pe imunodozare la punctul de îngrijire pentru o detectare automată a TB. Antigenul CFP10-ESAT6 al M. tuberculosis a fost utilizat ca țintă pentru depistarea precoce a tuberculozei utilizând strategia POC bazată pe benzi LFIA. O platformă interesantă bazată pe semnale optice este implementată ca o schimbare de culoare în zona de detecție, vizibilă cu ochiul liber. Nanoparticulele de aur (AuNPs) au fost utilizate ca sondă de culoare pentru detectarea unei ținte de interes. Imaginea de microscopie electronică cu transmisie de înaltă rezoluție (HRTEM) și analiza cu spectrofotometrul ultraviolet-vizibil (UV-Vis) au confirmat faptul că AuNP-urile sintetizate au fost adecvate pentru imunoanalizatorul proiectat. Platforma constă în AuNPs conjugate cu anticorpi specifici (Ab) pentru a capta antigenul de M. tuberculosis. Sub efectul capilar, imunoreacțiile sandwich AuNP-Ab-antigen au fost realizate pe plăcuța de testare a benzii imunologice, care poate fi observată prin semnalul de culoare de pe linia de testare a benzii cu un timp scurt de testare. În plus, biosenzorul nou dezvoltat a fost utilizat pentru detectarea antigenului CFP10-ESAT6 în probele de spută umană, cu rezultate satisfăcătoare. Benzile colorate caracteristice permit detectarea vizuală (cu ochiul liber) a analitului țintă fără instrumentar. Acest sistem de diagnosticare neinvaziv, care se bazează pe detectarea sputei, ar putea oferi teste de diagnostic ușor de utilizat și la prețuri accesibile în țările în curs de dezvoltare.
1. Introducere
Tuberculoza (TB) este una dintre cele mai mortale boli infecțioase care a devenit o problemă semnificativă de sănătate publică la nivel mondial . Boala este cauzată în principal de infecția cu Mycobacterium tuberculosis, care poate fi transmisă prin intermediul unor picături minuscule de aerosoli, cum ar fi tusea, strănutul sau chiar vorbirea de către o persoană infectată cu TB . Această boală contagioasă transmisă prin aer a provocat peste nouă milioane de cazuri noi anual, făcând din TB a doua cauză de deces după infecția cu virusul imunodeficienței umane (HIV) . Motivele principale ale ratei ridicate de prevalență a TB includ accesul inadecvat la metode eficiente de diagnosticare și incapacitatea de a trata în timp util toate cazurile infecțioase de TB pulmonară, permițând transmiterea continuă a M. tuberculosis în cadrul comunităților.
Standardul de aur actual pentru diagnosticarea TB este microscopia frotiului de spută, radiologia toracică și cultura solidă . Chiar dacă metodele sunt capabile să diagnosticheze TB, aceste teste sunt limitate de o sensibilitate slabă, o specificitate scăzută și un proces care necesită mult timp . Sistemele bazate pe amplificarea acidului nucleic au fost dezvoltate și oferă îmbunătățiri relative în ceea ce privește sensibilitatea, specificitatea și detectarea rapidă a M. tuberculosis față de tehnicile convenționale. Cu toate acestea, această metodă necesită un standard ridicat de competență tehnică și un echipament cu costuri ridicate și este utilizată numai în laboratoare competente care își pot permite reactivi de referință pentru a monitoriza performanța testului . Având în vedere că tuberculoza este o boală a sărăciei, în care peste 90% din povara mondială a tuberculozei are loc în țările cu venituri mici și medii, există o nevoie nesatisfăcută de metode de diagnosticare fiabile care să identifice boala tuberculozei rapid, eficient și precis, într-un mod economic, pentru a fi utilizate în medii cu resurse limitate.
Imunoanalizele pe bază de hârtie reprezintă o tehnică puternică cu o relevanță ridicată în biosensibilizare, deoarece a îndeplinit cerințele necesare pentru dispozitivele point-of-care (POC), inclusiv detecția rapidă, o cantitate mică de probă și un cost redus, astfel încât mai multe persoane să poată beneficia în mod convenabil de asistență medicală eficientă din punct de vedere al costurilor în zonele cu resurse limitate . Imunoanalizele POC pe bază de hârtie sunt compuse, în general, din trei componente majore, și anume, hârtia ca substrat, anticorpii ca element de detecție și moleculele reporter ca element de transformare a semnalului. Imunodozarea în flux lateral (LFIA), cunoscută și sub denumirea de biodetecție bazată pe benzi, este una dintre platformele existente pe bază de hârtie care reprezintă cea mai favorabilă strategie pentru analiza la fața locului și cu senzor de unică folosință (de unică folosință) . Este demn de menționat faptul că abordările electrochimice profită, de asemenea, de benzile de flux lateral . Cu toate acestea, LFIA prezintă unele dezavantaje; de exemplu, la concentrații scăzute de analit, această tehnologie poate prezenta probleme în ceea ce privește sensibilitatea .
Incorporarea de nanoparticule (NPs), cum ar fi nanoparticulele de aur (AuNPs) cu diferite elemente de biorecunoaștere (anticorpi, rețele de peptide, polimeri și aptameri), oferă o strategie eficientă pentru a îmbunătăți performanța sistemelor de detecție. Biosenzorul de hârtie pe bază de AuNP a inițiat recent studii intensive pentru diagnosticarea diferitelor boli infecțioase, cum ar fi malaria , virusul hepatitei B (VHB) , dengue , virusul Ebola (EBOV) și alte virusuri . În acest context, au fost demonstrate trei tipuri de imunoanalize pe bază de hârtie, inclusiv imunoanalize pe bază colorimetrică, pe bază de fluorescență și pe bază electrochimică. Deși imunoanalizele pe bază de fluorescență și cele pe bază electrochimică prezintă merite avansate în ceea ce privește sensibilitatea, acestea au implicat, de asemenea, problemele legate de funcționarea în mai multe etape și de dependența de cititor în timpul detecției, ceea ce reduce confortul utilizatorilor finali. Între timp, avantajele imunoanalizei bazate pe colorimetrie includ costuri reduse, fără echipament, rapid, lizibil cu ochiul liber și potrivit pentru screening-ul de mare randament la fața locului; cu toate acestea, îmbunătățirile în ceea ce privește acuratețea, sensibilitatea și cuantificarea sunt încă provocările sale .
În ceea ce privește platformele de detecție portabile pentru POC, în special pentru detectarea TB, LFIA bazată pe colorimetrie pare a fi un bun început, deoarece această metodă a realizat diagnosticarea rapidă în condiții de teren, precum și o operare simplă. În plus, depistarea timpurie este esențială pentru a permite inițierea la timp a tratamentului antituberculos, ceea ce reprezintă cheia pentru reducerea mortalității, precum și pentru evitarea epidemiei de tuberculoză. Pentru a realiza acest lucru, ne-am concentrat asupra proteinelor secretorii ale M. tuberculosis adecvate pentru detectarea timpurie a tuberculozei. S-a constatat că proteina filtratului de cultură de 10 kDa (CFP10) și ținta antigenului secretat timpuriu de 6 kDa (ESAT6) sunt codificate de genele Rv3874 și, respectiv, Rv3875. Aceste gene sunt localizate în regiunea de diferență-1 (RD-1) din genomul virulent al M. tuberculosis, care sunt antigene puternice ale celulelor T recunoscute la peste 70% dintre pacienții cu tuberculoză. O descoperire interesantă a fost aceea că ESAT6 și partenerul său proteic, CFP10, se leagă strâns unul de celălalt într-un raport de 1 : 1 prin interacțiuni hidrofobe și Van der Waals pentru a forma un complex proteic ESAT6-CFP10. Ambele proteine adoptă o structură stabilă, complet pliată în cadrul complexului, cu aproximativ două treimi din coloana vertebrală într-o conformație elicoidală regulată . Meher și colaboratorii au raportat că formarea complexului ESAT6-CFP10 a dus la modificări structurale, la îmbunătățirea termodinamicii și a stabilității biochimice și la pierderea legăturii cu membranele fosfolipidice . Acest lucru sugerează că ESAT6 și CFP10 sunt active ca un complex și pot conferi mai multe avantaje funcționale, inclusiv un control mai strâns al activității proteinelor de reglementare, cum ar fi factorii de transcripție, și un mecanism general pentru creșterea specificității interacțiunilor proteină-proteină și proteină-acid nucleic . În plus, lucrarea raportată de Renshaw și colaboratorii a arătat că asocierea antigenului CFP10-ESAT6 a crescut performanța de diagnosticare a testului în comparație cu un singur antigen .
În această lucrare, meritele LFIA și ale CFP10-ESAT6 ca biomarker proteic de identificare au fost combinate și, pentru prima dată, am dezvoltat o bandă de testare de unică folosință bazată pe imunoanaliză ca biosenzor nou pentru detectarea rapidă a TB folosind ochiul liber. Este demn de remarcat faptul că strategia care a încorporat AuNPs ca etichetă joacă un rol crucial în îmbunătățirea efectului vizual și a intensităților de răspuns ale LFIA. Proiectarea și principiul de răspuns al acestei metode nou dezvoltate sunt ilustrate în figura 1. Anticorpii sunt legați pe diferite poziții ale LFIA pentru a capta antigene țintă, iar reactivii detectori colorați marcați (AuNPs) pe anticorpi dau răspunsuri colorate pe zona de testare și pe zona de control de pe LFIA. Benzile colorate caracteristice permit detectarea vizuală (cu ochiul liber) a analitului țintă. S-a utilizat un format de imunodozare de tip sandwich pentru a amplifica semnalul de detecție, precum și pentru a crește selectivitatea senzorului față de biomarkerii specifici TB. Apariția atât a unei linii de testare colorate, cât și a unei linii de control colorate indică un rezultat pozitiv [figura 1(a)], în timp ce observarea unei singure linii de control colorate indică un rezultat negativ [figura 1(b)]. Linia de control indică faptul că proba a migrat pe membrană așa cum era prevăzut, indiferent dacă analitul este prezent sau nu în probă. În cazul în care nu apare nicio linie colorată, se consideră că rezultatul nu este valid; astfel, testul trebuie repetat.
(a)
(b)
(a)
(b)
Am demonstrat, de asemenea, eficacitatea LFIA dezvoltate pentru detectarea CFP10-ESAT6 în spută, colectată din probe umane de la persoane infectate cu TB. Studiul a sugerat că metoda fără teste de sânge prin detectarea biomarkerilor din spută ar putea fi valoroasă în detectarea precoce a bolii TB, în special în cazurile HIV-pozitive și, astfel, ar putea oferi aplicații potențiale largi în analiza clinică și utilizarea la domiciliu fără implementarea unui laborator periferic.
2. Materiale și metode
2.1. Materiale și reactivi
Anticorp policlonal anti-CFP10, anticorp anti-M. tuberculosis de iepure, conjugat HRP anti-M. tuberculosis de iepure, anticorp IgG de capră anti-rabbit, proteina ESAT-6-like esxB (CFP-10) din M. tuberculosis și antigene imunogene recombinate MPT64 din M. tuberculosis au fost achiziționate de la Cusabio (Selangor, Malaezia). Albumina serică bovină (BSA), serul uman, clorura de aur (III) trihidrat, carbonat de potasiu, tablete de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și Tween-20 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Substratul ELISA 3,30,5,50-Tetrametilbenzidină (TMB) și citratul de sodiu au fost obținute de la Abcam (Cambridge, Regatul Unit) și, respectiv, R&M Chemicals (Essex, Regatul Unit). Au fost utilizate probe de spută de la pacienții de la Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM), Kelantan, Malaezia, cu numerele de identificare TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280 și SA217. Pentru proba de spută, s-a renunțat la necesitatea consimțământului, deoarece proba de spută reprezintă doar probe rămase care au fost utilizate în scopuri de laborator de HUSM. În plus, protocolul utilizat în acest studiu a fost aprobat de Comitetul de cercetare și etică medicală (MREC) al Ministerului Sănătății din Malaezia (Numărul de aprobare: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).
2.2. Sinteza nanoparticulelor de aur
Nanoparticulele de aur (AuNPs) au fost sintetizate prin metoda reducerii citratului, așa cum s-a raportat anterior . O soluție de clorură de aur a fost preparată prin dizolvarea clorurii de aur în 100 ml de apă deionizată, iar soluția preparată a fost depozitată ferită de lumină. Apoi, o soluție de citrat de sodiu a fost proaspăt preparată înainte de utilizare prin dizolvarea unui citrat de sodiu în 100 ml de apă deionizată și filtrată. Soluția de clorură de aur a fost încălzită până la fierbere, iar citratul de sodiu a fost adăugat în mod judicios, picătură cu picătură. După 10 min, balonul a fost plasat într-o baie de apă pentru a se răci timp de cel puțin 15 min. AuNP-urile rezultate au fost apoi colectate și depozitate într-un frigider la 4°C până la o utilizare ulterioară. AuNPs sintetizate au fost apoi caracterizate cu ajutorul imaginii UV-Vis și HRTEM.
2.3. Conjugarea anticorpului de iepure anti-M. tuberculosis cu AuNPs
Conjugarea anticorpului de iepure anti-M. tuberculosis cu AuNPs a fost preparată în conformitate cu metodele descrise anterior, cu mici modificări. Pe scurt, 6 μl de anticorp anti-M. tuberculosis de iepure (12 μg/ml) au fost adăugați la 5 ml de soluție de aur coloidal. Înainte de utilizare, valoarea pH-ului soluției de AuNP pregătite a fost ajustată la 8,0 utilizând carbonat de potasiu 0,2 M și HCl 0,1 M. Amestecul a fost agitat timp de 10 minute și s-a adăugat 10% albumină serică bovină. Amestecul a fost incubat timp de 30 min și depozitat peste noapte la 4°C. După aceea, amestecul a fost centrifugat timp de 10 min la 11.000 g pentru a elimina anticorpii neconconjugați. Peletul a fost resuspendat cu tampon de diluare pasivă (PDB) echivalent cu 1/10 din volumul original. Citirea densității optice (OD) a fost studiată cu ajutorul UV-Vis la 540 nm pentru a obține . În cele din urmă, soluția de anticorpi conjugați cu AuNP a fost filtrată printr-un filtru de acetat de celuloză de 0,45 μm.
2.4. Spottarea liniei de testare și a liniei de control pe membrana de nitroceluloză
Anticorpul IgG de iepure a fost distribuit pe membrana de nitroceluloză ca linie de control la o concentrație de 1 mg/ml. Anticorpul anti-M. tuberculosis de iepure la o concentrație de 1 mg/ml a fost distribuit pe o membrană de nitroceluloză ca linie de testare. Anticorpul a fost preparat în tampon PBS și 1% zaharoză. Membrana de nitroceluloză a fost uscată la temperatura camerei și depozitată la 4°C.
2.5. Benzile de imunodozare în flux lateral
Benziile LFIA au fost achiziționate de la Kestrel Bio Sciences (Thailand) Co., Ltd., Ltd. Construcția LFIA este demonstrată în figura 2. Banda LFIA este concepută cu trei tampoane suprapuse plasate pe un card de suport: tampon de probă (Millipore C048, ), membrană (Whatman FF 60/100, ) și tampon de stoarcere (Whatman 470, ). Benzile LFIA au fost asamblate secvențial pe cardul suport cu o suprapunere de 1-2 mm. Anticorpul anti-M. tuberculosis de iepure conjugat cu o soluție de AuNP cu a fost imobilizat pe un tampon de conjugare (0,5 μl pe 1 mm). Tamponul conjugat a fost uscat la 37°C timp de 1 h. Apoi, anticorpul IgG anti-rabbit de capră și anticorpul anti-M. tuberculosis de iepure au fost aliniate pe membrana de nitroceluloză pentru a forma linia de control și, respectiv, linia de testare. Membranele au fost uscate la temperatura camerei peste noapte. În cele din urmă, benzile LFIA au fost tăiate în benzi de 4 mm lățime și depozitate la 4°C până la utilizare.
Eșantioanele de spută au fost diluate cu tampon de liză, iar 100 μl din proba preparată au fost aplicate pe tamponul de probă. Benzile pregătite au fost așezate orizontal timp de 5-10 minute pentru a permite curgerea probei de pe suportul de probă pe suportul de absorbție. S-a observat apariția culorii roșiatice la linia de testare și la linia de control.
2.6. Testul ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) convențional
Pentru a confirma pozitivitatea și negativitatea probelor în comparație cu LFIA dezvoltat de noi, s-a efectuat un test ELISA semicantitativ. În acest scop, plăcile ELISA cu 96 de godeuri au fost acoperite cu 100 μl de anticorp anti-M. tuberculosis de iepure cu o concentrație de 1 μg/ml în tampon carbonat. Placa ELISA a fost acoperită cu parafilm și incubată timp de 2 h. Apoi, fiecare puț acoperit a fost spălat de 3 ori prin umplerea puțurilor cu tampon de spălare conținând PBS și Tween-20. Toate soluțiile au fost îndepărtate prin baterea plăcii de 2-3 ori pentru a elimina orice proteină nelegată. După etapa de spălare, placa ELISA a fost blocată prin adăugarea a 250 μl de tampon de blocare (PBS și BSA) timp de 30 de minute la temperatura camerei. Placa ELISA a fost spălată din nou de 3 ori cu soluție tampon de spălare și s-au adăugat în fiecare gode 100 μl de diferite concentrații de antigen CFP10-ESAT6 de M. tuberculosis în soluție tampon de diluare a anticorpilor care conține PBS, Tween-20 și BSA. Toate antigenele au fost testate în triplu exemplar și incubate peste noapte la 4°C. După incubarea antigenului, placa a fost spălată din nou de 3 ori cu ajutorul tamponului de spălare și s-au adăugat 100 μl de conjugat HRP de iepure anti-M. tuberculosis în fiecare gode timp de 1 h, urmată de etapa de spălare și de adăugarea soluției de substrat TMB. Va apărea culoarea albastră, care indică prezența anticorpului de detecție marcat cu legare complementară anticorp-antigen. În cele din urmă, s-au adăugat 100 μl de soluție de oprire (0,5 M H2SO4) și s-a obținut citirea absorbanței cu ajutorul unui cititor de microplăci ELISA.
3. Rezultate și discuții
3.1. Validarea formatului sandviș folosind procedura ELISA convențională
Pentru a explica mai bine mecanismul de detecție al strategiei sandviș și pentru a evalua rolurile specifice ale anticorpilor angajați, s-au efectuat experimente de control. Analiza ELISA a fost utilizată pentru a verifica legarea anticorpului și a antigenului pe linia de testare, așa cum se arată în figura 3.
(a)
(b)
(a)
(b)
Anticorpul de detecție a fost marcat cu enzima HRP care va induce un semnal colorat atunci când s-a adăugat TMB. S-a format complexul sandwich ELISA, care include anticorpul de captură, antigenul și anticorpul de detecție [figura 3(a)]. După cum se poate observa în figura 3(a), godeul de control nu prezintă niciun semnal colorat, deoarece absența antigenului nu va determina nicio legare a anticorpului de detecție marcat. Placa ELISA prezintă un semnal albastru în godeurile cu antigen și nu se observă niciun semnal albastru în absența antigenului. Rezultatele au confirmat faptul că proteina de fuziune CFP10-ESAT6 a fost un antigen candidat excelent cu o specificitate ridicată pentru anticorpii selectați utilizați în această lucrare pe baza formatului sandwich de imunodiagnosticare în ELISA.
Deși ELISA arată o metodă eficientă pentru determinarea CFP10-ESAT6 în M. tuberculosis, procedurile de spălare plictisitoare și marcarea necesară a anticorpilor pot limita utilizarea pe scară largă a acestei metode pentru detectarea simplă și rapidă a TB. Astfel, în studiul de față, am stabilit o platformă simplă, portabilă, ușor de utilizat și rapidă pentru determinarea anticorpilor anti-CFP10-ESAT6 pentru diagnosticarea TB pe baza LFIA în format sandwich, așa cum se arată în figura 3(b). Utilizarea AuNPs permite observarea culorii roșiatice. Un rezultat pozitiv indică prin observare atât o linie de testare colorată, cât și o linie de control colorată, în timp ce observarea unei singure linii de control colorate indică un rezultat negativ. Actualul dispozitiv de curgere laterală este promițător pentru utilizarea în aplicații în care AuNPs se atașează prin evenimente specifice de recunoaștere biologică (configurație de legare la țintă) atunci când este prezent analitul țintă (CFP10-ESAT6).
3.2. Caracterizarea anticorpilor conjugați cu nanoparticule de aur
Nuanțele AuNPs sintetizate au fost caracterizate prin utilizarea UV-Vis și HRTEM pentru a obține lungimea de undă a absorbanței maxime () și, respectiv, pentru a determina morfologia AuNPs care au fost sintetizate prin metoda de reducere cu citrat. Pe baza figurii 4(a), particula de AuNPs absoarbe lumina la o absorbție de 520 nm datorită rezonanței plasmonului de suprafață. Imaginea HRTEM prezentată în figura 4(b) reprezintă o imagine clară a unor AuNPs sferice mai puțin agregate între ele, iar dimensiunea medie a AuNPs obținute este de aproximativ ~30 nm, așa cum este descrisă în figura 4(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Abordarea de marcare a AuNP-urilor a fost utilizată ca o detecție rapidă a M. tuberculosis folosind benzi de flux lateral. AuNP-urile care au fost conjugate cu anticorpul anti-M. tuberculosis de iepure au fost optimizate pentru a obține o culoare roșie rubinie stabilă pentru a apărea ca semnal în linia de testare și în linia de control. Stabilitatea coloidului de aur a fost examinată pe baza absorbției coloidului după adăugarea de diferite concentrații de anticorp. Concentrația optimă de anticorp stabilizator a fost determinată prin utilizarea diferitelor concentrații de anticorp. Pentru conjugare, anticorpii sunt atașați la suprafața AuNP prin interacțiuni fizice și chimice . Anticorpul este adsorbit nespecific pe AuNP, în timp ce stabilitatea în soluția coloidală a fost asigurată de nanoparticulele încărcate negativ . Stabilitatea coloidului de aur a fost examinată pe baza absorbției coloidului după adăugarea de diferite concentrații de anticorp.
Figura 5(a) prezintă modificările de culoare ale soluției de AuNP care conține anticorp cu diferite concentrații. Culoarea soluției s-a schimbat din roșu în albastru după adăugarea unei concentrații mici de anticorp anti-M. tuberculosis de iepure în prezența NaCl. Culoarea roșie a AuNP-urilor rămâne într-o stare stabilă atunci când s-a adăugat o concentrație mare sau o cantitate excesivă de anticorp. Concentrația minimă de anticorp pentru a stabiliza aurul coloidal a fost de aproximativ 10 μg/ml, după cum se arată în figura 5(b). La 10 μg de anticorp la 1 ml de soluție de aur, anticorpul a fost legat în mod adecvat de AuNPs. Mai multă proteină s-a legat de AuNPs pe măsură ce concentrația de anticorp crește, în care toate situsurile de legare disponibile au fost ocupate. Figura 5(c) prezintă spectrele de absorbție UV-Vis ale diferitelor concentrații de anticorp conjugat cu soluția de AuNP. Absorbția maximă SPR pentru soluțiile de la 1 la 8 (de la anticorpi cu concentrație mare) arată aproximativ la 550 nm, în timp ce soluțiile de la 9 la 11 (anticorpi cu concentrație mai mică) arată o lungime de undă lungă deplasată la 570 nm. Acest lucru se datorează agregării AuNP-urilor prezentate în soluțiile 9-11.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. Caracterizarea imunoanalizei în flux lateral pentru detectarea antigen-anticorp TB
S-au construit benzi de testare așa cum se arată în figura 6. Există trei elemente principale într-o bandă: un tampon conjugat, o membrană și un tampon absorbant. Membrana Whatman a fost utilizată astfel încât fluxul de probe să se desfășoare fără probleme. Proba din tamponul de probă va curge prin tamponul conjugat până la tamponul de absorbție. Tamponul de absorbție a tras proba peste liniile de testare și de control prinzând excesul de probă. Anticorpul conjugat cu AuNPs a fost depus pe plăcuța de conjugare. Rabinul anti-M. tuberculosis a fost aliniat pe membrana despre care se știa că este linia de testare. Cealaltă linie a fost aliniată cu anticorpul de capră anti-IgG de iepure și cunoscută ca linie de control. Anticorpul de pe linia de testare va capta antigenul care a fost legat de anticorpul marcat cu AuNPs. Ca urmare, pe linia de testare se poate observa un semnal de culoare roșiatică. Anticorpul IgG de iepure de pe linia de control va capta restul anticorpului marcat cu AuNP și va putea prezenta întotdeauna un semnal ca test de validare.
(a)
(b)
(a)
(b)
Linia de control de pe membrana de nitroceluloză a fost optimizată astfel încât un semnal roșiatic clar să poată fi observat cu ochiul liber. Benzile de testare au fost testate prin tampon de liză (fără antigen), iar tamponul a fost lăsat să curgă lateral pe membrana de nitroceluloză. Semnalul roșiatic de pe linia de control poate fi observat așa cum se arată în figura 6(a) cu ochiul liber după 5-10 minute de încărcare cu tampon. La testarea benzilor de curgere laterală cu un eșantion clinic de pacienți cu TB pozitivă, s-au distribuit 100 μl de soluție pe plăcuța de probă. După cum se arată în figura 6(b), un semnal roșiatic a putut fi observat pe linia de testare și pe linia de control. Acest rezultat indică faptul că anticorpul de pe linia de testare s-a legat cu succes de antigenul CFP10-ESAT6 din proba de spută.
LFIA dezvoltat a fost testat în continuare cu diferite tipuri de antigen pentru a verifica specificitatea benzilor. Linia de testare a fiecărei benzi care a fost pătată cu anticorpul a fost observată după 5-10 min după ce fiecare țintă curge de pe plăcuța de probă pe plăcuța de stoarcere. După cum se arată în figura 7, semnalul a apărut pe linia de testare a benzii atunci când proba de spută a fost încărcată după 10 min. Între timp, nu s-a observat niciun semnal pe linia de testare a benzii de control, ceea ce indică absența oricărei ținte a probei. Rezultatele arată ținta specifică a anticorpului pe linia de testare atunci când niciun semnal nu a putut fi observat pe linia de testare atunci când au fost testate pe benzi antigenul recombinant MPT64, proteină imunogenă a M. tuberculosis, și albumina serică umană. Prin urmare, LFIA dezvoltată detectează în mod specific proba de spută care conține CFP10-ESAT6, iar anticorpul de pe linia de testare captează doar ținta specifică a probei.
3.4. Studiul de reproductibilitate
Studiul de reproductibilitate al benzilor LFIA dezvoltate a fost aplicat prin prepararea a trei benzi din același lot pentru fiecare pacient cu probă de spută clinică. Pe baza figurii 8, fiecare probă de spută de la diferiți pacienți TB-pozitivi (1-5) și pacienți TB-negativi (6) a fost testată pe benzile LFIA, iar rezultatele au fost observate după ce probele de spută au fost încărcate pe plăcuța de probă. Rezultatele de pe fiecare bandă arată că atât linia de testare, cât și linia de control prezintă semnal după 5-10 min. Prin urmare, antigenul CFP10-ESAT6 al M. tuberculosis din proba de spută clinică a pacienților cu tuberculoză a fost detectat de anticorpul de pe fiecare linie de testare a benzilor. Aceste rezultate au sugerat că precizia fiecărei benzi a fost evaluată prin alegerea aleatorie a LFIA pentru detectarea probei de analit. Pentru a verifica în continuare că schimbarea de culoare se datorează atașării anticorpului țintă complementar la anticorpul de captare de pe banda LFIA dezvoltată, s-a folosit un test suplimentar utilizând proba de spută de la un pacient TB-negativ (pacientul 6). După încărcarea probei pe plăcuța de probă a benzii timp de 5-10 minute, testul nu a arătat nicio modificare semnificativă a culorii pe linia de testare în comparație cu linia de control, ceea ce sugerează absența legăturii nespecifice a antigenului țintă cu anticorpul de captare pe zona liniei de testare. Acest lucru dovedește că detectarea culorii a avut loc prin atașarea antigenului țintă complementar al M. tuberculosis cu anticorpul funcționalizat pe banda LFIA dezvoltată.
(a)
(b)
(c)
.
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)(f)
(f)
4. Concluzii
Am demonstrat o metodă rapidă, simplă și accesibilă bazată pe LFIA pentru un sistem ultrasensibil de detectare cu ochiul liber a TB. Detecția CFP10-ESAT6 folosind procedura în format sandwich prezentată în acest nou imunosenzor dezvoltat arată o platformă simplă și ușoară care poate oferi o strategie alternativă rapidă cu potențial de a fi utilizată în diagnosticarea TB în comparație cu metoda ELISA. Imunoanalizatorul sandwich dezvoltat a arătat un răspuns excepțional la detectarea CFP10-ESAT6 în probele de spută pentru aplicații clinice și a demonstrat o sensibilitate, o specificitate și o reproductibilitate ridicate ca senzor de unică folosință. Acest imunodozator pe bază de bandă ar putea oferi un mare potențial în aplicații POC și cu costuri reduse pentru diagnosticarea TB.
Date disponibile
Datele utilizate pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt incluse în cadrul articolului.
Conflicte de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Recunoștințe
Autorii doresc să mulțumească Ministerului Învățământului Superior din Malaezia și Universiti Putra Malaysia pentru sprijinul financiar acordat prin intermediul Malaysia Research University Network (MRUN)-Universiti Putra Malaysia (UPM) (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230). Mulțumiri speciale se adresează, de asemenea, lui Siti Suraiya de la HUSM Kubang Kerian, Kelantan, pentru ajutorul acordat în testarea eșantioanelor reale.
.
Lasă un răspuns