Lateral Flow Immunoassay for Naked Eye Detection of Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Tuberculose (TB) is een infectieziekte veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis. Opsporing en beheersing van besmettelijke ziekten is een groot probleem, vooral in ontwikkelingslanden. Laterale flow immunoassay (LFIA) is geïntroduceerd als een handheld immunoassay-gebaseerd point-of-care platform voor een geautomatiseerde detectie van TB. Het CFP10-ESAT6 antigeen van M. tuberculosis werd gebruikt als doelwit voor de vroege opsporing van TB met behulp van een LFIA strip-gebaseerde POC strategie. Een interessant platform gebaseerd op optische signalen wordt geïmplementeerd als een kleurverandering in het detectiegebied die zichtbaar is met het blote oog. De gouden nanodeeltjes (AuNPs) werden gebruikt als de kleur probe voor de detectie van een doelwit van belang. Het hoge-resolutie transmissie elektronenmicroscopie (HRTEM) beeld en de ultraviolet-zichtbare spectrofotometer (UV-Vis) analyse bevestigden dat de gesynthetiseerde AuNPs geschikt waren voor de ontworpen immunoassay. Het platform bestaat uit AuNPs geconjugeerd met specifieke antilichamen (Ab) om het antigeen van M. tuberculosis te vangen. Onder het capillaire effect werden sandwich-immunoreacties van AuNP-Ab-antigeen uitgevoerd op het testkussentje van de immunostrip, wat kan worden waargenomen door het kleursignaal op de testlijn van de strip met een korte assaytijd. Bovendien is de nieuw ontwikkelde biosensor met bevredigende resultaten gebruikt voor de detectie van CFP10-ESAT6-antigeen in menselijke sputummonsters. De karakteristieke gekleurde banden maken visuele detectie (met het blote oog) van de doelanalyt mogelijk zonder instrumentatie. Dit niet-invasieve diagnosesysteem dat sputum-gebaseerde opsporing is zou gebruikersvriendelijke en betaalbare diagnostische tests in ontwikkelingslanden kunnen verstrekken.

1. Inleiding

Tuberculose (TB) is een van de dodelijkste infectieziekten die wereldwijd een belangrijk probleem voor de volksgezondheid is geworden. De ziekte wordt hoofdzakelijk veroorzaakt door de infectie van Mycobacterium tuberculosis, die kan worden overgedragen via minieme aërosoldruppeltjes zoals hoesten, niezen of zelfs praten door een geïnfecteerde TB-persoon . Deze door de lucht verspreide besmettelijke ziekte veroorzaakt jaarlijks meer dan negen miljoen nieuwe gevallen, waardoor TB de tweede belangrijkste doodsoorzaak is na besmetting met het humane immunodeficiëntievirus (HIV) . De belangrijkste redenen voor de hoge prevalentie van TB zijn ontoereikende toegang tot effectieve diagnostische methoden en het onvermogen om alle besmettelijke gevallen van pulmonale TB tijdig te behandelen, waardoor voortdurende M. tuberculosis-transmissie binnen gemeenschappen mogelijk is.

De huidige gouden standaard voor TB-diagnose is sputumuitstrijkmicroscopie, thoraxradiologie en vaste cultuur . Hoewel deze methoden in staat zijn om TB te diagnosticeren, zijn deze tests beperkt door een slechte gevoeligheid, lage specificiteit, en een tijdrovend proces . De op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde systemen zijn ontwikkeld en bieden relatieve verbeteringen in gevoeligheid, specificiteit en snelle detectie van M. tuberculosis ten opzichte van conventionele technieken. Deze methode vereist echter een hoog niveau van technische bekwaamheid en dure apparatuur en wordt alleen gebruikt in bekwame laboratoria die zich referentiereagentia kunnen veroorloven om de assayprestaties te controleren . Aangezien TB een ziekte van armoede is, waarbij meer dan 90% van de wereldwijde last van TB plaatsvindt in lage-inkomenslanden en midden-inkomenslanden, is er een onvervulde behoefte aan betrouwbare diagnostische methoden om de TB-ziekte snel, efficiënt en nauwkeurig te identificeren op een economische manier die kan worden gebruikt in omgevingen met beperkte middelen.

Papier-gebaseerde immunoassays vertegenwoordigen een krachtige techniek met hoge relevantie in biosensing, omdat het de vereisten bereikt die nodig zijn voor point-of-care (POC) apparaten, waaronder snelle detectie, een kleine hoeveelheid monster, en lage kosten, zodat meer mensen gemakkelijk kosteneffectieve gezondheidszorg kunnen ontvangen in gebieden met beperkte middelen . De op papier gebaseerde POC immunoassays bestaan over het algemeen uit drie belangrijke componenten, namelijk papier als substraat, antilichamen als detectie-element, en reporter moleculen als signaalomvormend element. Laterale flow immunoassay (LFIA), ook bekend als strip-gebaseerde biosensing, is een van de bestaande papier-gebaseerde platforms die de meest gunstige strategie vertegenwoordigen voor on-site en one-shot sensor (disposable) analyse . Vermeldenswaard is dat elektrochemische benaderingen ook gebruik maken van lateral flow strips . LFIA heeft echter enkele nadelen; bij lage concentraties van de analyt kan deze technologie bijvoorbeeld problemen opleveren met betrekking tot de gevoeligheid .

Incorporatie van nanodeeltjes (NP’s), zoals gouden nanodeeltjes (AuNPs) met verschillende biorecognitie-elementen (antilichamen, peptide-arrays, polymeren en aptameren), biedt een effectieve strategie om de prestaties van de detectiesystemen te verbeteren. De op AuNP gebaseerde papieren biosensor heeft recent intensieve studies aangevat voor de diagnose van verschillende infectieziekten, zoals malaria, hepatitis B virus (HBV), dengue, Ebola virus (EBOV), en andere virussen. In dit verband zijn drie soorten immunoassays op papier gedemonstreerd, waaronder colorimetrische, fluorescentie- en elektrochemische immunoassays. Hoewel de immunoassays op basis van fluorescentie en elektrochemie geavanceerde verdiensten vertonen in termen van gevoeligheid, hebben zij ook te maken met de problemen van meerstapshandelingen en afhankelijkheid van het uitleesapparaat tijdens de detectie, hetgeen het gemak van de eindgebruikers vermindert. Ondertussen zijn de voordelen van colorimetrische immunoassay lage kosten, zonder apparatuur, snel, met het blote oog leesbaar, en geschikt voor high-throughput screening ter plaatse; echter, de verbeteringen in nauwkeurigheid, gevoeligheid, en kwantificering zijn nog steeds de uitdagingen.

Wat betreft handheld detectieplatforms voor de POC, met name voor TB detectie, colorimetrische-gebaseerde LFIA lijkt een goede start te zijn, omdat deze methode snelle diagnostiek in het veld omstandigheden en eenvoudige bediening realiseerde. Bovendien is vroegtijdige opsporing van cruciaal belang om tijdig met een antituberculosebehandeling te kunnen beginnen, wat de sleutel is om het sterftecijfer te verlagen en een TB-epidemie te voorkomen. Om dat te bereiken, hebben wij ons gericht op M. tuberculosis secretorische eiwitten die geschikt zijn voor de vroege opsporing van TB. Het 10 kDa kweekfiltraat-eiwit (CFP10) en het 6 kDa early secreted antigen target (ESAT6) bleken gecodeerd te worden door respectievelijk de Rv3874- en Rv3875-genen. Deze genen bevinden zich in de regio van verschil-1 (RD-1) van het virulente M. tuberculosis-genoom, die krachtige T-celantigenen zijn die bij meer dan 70% van de TB-patiënten worden herkend. Een opwindende ontdekking was dat ESAT6 en zijn eiwitpartner, CFP10, zich hecht aan elkaar binden in een verhouding van 1 : 1 door hydrofobe en Van der Waals interacties om een ESAT6-CFP10 eiwitcomplex te vormen. Beide eiwitten nemen in het complex een stabiele, volledig gevouwen structuur aan, met ongeveer tweederde van de ruggengraat in een regelmatige spiraalvormige conformatie. Meher en medewerkers meldden dat de complexvorming van ESAT6-CFP10 resulteerde in structurele veranderingen, verbeterde thermodynamica en biochemische stabiliteit, en verlies van binding aan fosfolipidemembranen. Dit suggereert dat ESAT6 en CFP10 actief zijn als een complex en verschillende functionele voordelen kunnen bieden, waaronder een striktere controle van de activiteit van regulerende eiwitten zoals transcriptiefactoren, en een algemeen mechanisme voor het verhogen van de specificiteit van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties . Bovendien toonde het werk gerapporteerd door Renshaw en collega’s aan dat de combinatie van CFP10-ESAT6 antigeen de diagnostische prestaties van assay verhoogde in vergelijking met een enkel antigeen.

Hierin in dit werk werden de verdiensten van LFIA en CFP10-ESAT6 als de identificatie eiwit biomarker gecombineerd, en voor de eerste keer ontwikkelden we een wegwerp immunoassay-gebaseerde teststrip als een nieuwe biosensor voor snelle detectie van TB met behulp van het blote oog. Opmerkelijk is dat de strategie met AuNPs als label een cruciale rol speelt in het verbeteren van het visuele effect en de responsintensiteit van LFIA. Het ontwerp en het reactieprincipe van deze nieuw ontwikkelde methode worden geïllustreerd in figuur 1. Antilichamen worden op verschillende posities van de LFIA gebonden om doelantigenen te vangen, en de gekleurde detectiereagentia met een label (AuNPs) op de antilichamen geven de gekleurde respons op de testzone en de controlezone op de LFIA. De karakteristieke gekleurde banden maken visuele detectie (met het blote oog) van het doelanalyt mogelijk. Er is gebruik gemaakt van een sandwich immunoassay-formaat om het detectiesignaal te versterken en de selectiviteit van de sensor ten opzichte van de TB-specifieke biomarkers te vergroten. Het verschijnen van zowel een gekleurde testlijn als een gekleurde controlelijn wijst op een positief resultaat (figuur 1(a)), terwijl de waarneming van een enkele gekleurde controlelijn wijst op een negatief resultaat (figuur 1(b)). De controlelijn geeft aan dat het monster zoals bedoeld over het membraan is gemigreerd, ongeacht of de analyt al dan niet in het monster aanwezig is. Indien er helemaal geen gekleurde lijnen verschijnen, wordt dit beschouwd als een ongeldig resultaat; de test moet dan worden overgedaan.

(a)

(b)

(a)
(b)

Wij toonden ook de doeltreffendheid aan van de ontwikkelde LFIA voor de detectie van CFP10-ESAT6 in sputum, verzameld uit menselijke monsters van TB-geïnfecteerde personen. De studie suggereerde dat de bloedproefvrije methode via sputumdetectie van biomarkers van waarde zou kunnen zijn bij de vroege opsporing van TB-ziekte, vooral bij HIV-positieve gevallen, en dus zou kunnen zorgen voor brede potentiële toepassingen in klinische analyse en thuisgebruik zonder perifere laboratoriumimplementatie.

2. Materialen en Methoden

2.1. Materialen en Reagentia

Polyclonaal anti-CFP10 antilichaam, konijn anti-M. tuberculosis, konijn anti-M. tuberculosis HRP conjugaat, geit anti-rabbit IgG antilichaam, M. tuberculosis ESAT-6-achtig eiwit esxB (CFP-10), en recombinant M. tuberculosis immunogeen eiwit MPT64 antigenen werden aangekocht bij Cusabio (Selangor, Maleisië). Boviene serumalbumine (BSA), humaan serum, goud(III)chloride trihydraat, kaliumcarbonaat, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten, en Tween-20 werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 3,30,5,50-Tetramethylbenzidine (TMB) ELISA-substraat en natriumcitraat werden respectievelijk verkregen van Abcam (Cambridge, UK) en R&M Chemicals (Essex, UK). Sputummonsters van patiënten van Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM), Kelantan, Maleisië, werden gebruikt met identificatienummers TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280, en SA217. Voor het sputummonster werd afgezien van de noodzaak van toestemming omdat het sputummonster alleen restmonsters zijn die zijn gebruikt voor laboratoriumdoeleinden van HUSM. Bovendien werd het in deze studie gebruikte protocol goedgekeurd door de Commissie Medisch Onderzoek en Ethiek (MREC) van het Ministerie van Volksgezondheid van Maleisië (goedkeuringsnummer: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).

2.2. Synthese van gouden nanodeeltjes

De gouden nanodeeltjes (AuNPs) werden gesynthetiseerd door citraatreductie methode zoals eerder gemeld . Een goudchloride-oplossing werd bereid door goudchloride op te lossen in 100 ml gedeïoniseerd water, en de bereide oplossing werd beschermd tegen licht opgeslagen. Vervolgens werd vóór gebruik een natriumcitraatoplossing vers bereid door natriumcitraat op te lossen in 100 ml gedeïoniseerd water en te filtreren. De goudchloride-oplossing werd verwarmd tot de oplossing kookte, en het natriumcitraat werd druppelsgewijs toegevoegd. Na 10 minuten werd de kolf in een waterbad geplaatst om gedurende ten minste 15 minuten af te koelen. De resulterende AuNPs werden vervolgens verzameld en opgeslagen in een koelkast bij 4°C tot verder gebruik. De gesynthetiseerde AuNPs werden vervolgens gekarakteriseerd met behulp van UV-Vis en HRTEM image.

2.3. Conjugatie van Konijn Anti-M. tuberculosis Antilichaam met AuNPs

Conjugatie van konijn anti-M. tuberculosis antilichaam met AuNPs werd bereid volgens de eerder beschreven methoden met een kleine wijziging. Kortom, 6 ul konijn anti-M. tuberculosis antilichaam (12 μg/ml) werd toegevoegd aan 5 ml colloïdaal goud oplossing. Vóór gebruik werd de pH-waarde van de bereide AuNP-oplossing op 8,0 gebracht met 0,2 M kaliumcarbonaat en 0,1 M HCl. Het mengsel werd gedurende 10 minuten geroerd, waarna 10% boviene serumalbumine werd toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 30 minuten geïncubeerd en ’s nachts bewaard bij 4°C. Daarna werd het mengsel gedurende 10 minuten bij 11.000 g gecentrifugeerd om niet-geconjugeerde antilichamen te verwijderen. De pellet werd geresuspendeerd met passieve verdunningsbuffer (PDB) tot 1/10 van het oorspronkelijke volume. De optische dichtheid (OD) werd bestudeerd met UV-Vis bij 540 nm om . Tenslotte werd de geconjugeerde antilichaam met AuNP oplossing gefiltreerd door een 0,45 μm celluloseacetaat filter.

2.4. Spotting of Test Line and Control Line on Nitrocellulose Membrane

Rabbit IgG antibody was dispensed op nitrocellulose membraan als controlelijn in een concentratie van 1 mg/ml. Konijn anti-M. tuberculosis-antilichaam in een concentratie van 1 mg/ml werd als testlijn op een nitrocellulosemembraan gespot. Het antilichaam werd bereid in PBS-buffer en 1% sucrose. Het nitrocellulosemembraan werd gedroogd bij kamertemperatuur en bewaard bij 4°C. Lateral Flow Immunoassay Strips

LFIA-strips werden gekocht bij Kestrel Bio Sciences (Thailand) Co., Ltd. De LFIA-constructie wordt getoond in figuur 2. De LFIA-strook is ontworpen met drie overlappende pads die op een steunkaart zijn geplaatst: monsterkussen (Millipore C048, ), membraan (Whatman FF 60/100, ), en wicking pad (Whatman 470, ). De LFIA-strips werden achtereenvolgens op de steunkaart aangebracht met een overlapping van 1-2 mm. Het konijn anti-M. tuberculosis antilichaam geconjugeerd met AuNP oplossing met werd geïmmobiliseerd op een conjugaat pad (0,5 ul per 1 mm). Het conjugaatkussen werd gedurende 1 uur gedroogd bij 37°C. Vervolgens werden geit anti-rabbit IgG-antilichaam en konijn anti-M. tuberculosis-antilichaam op het nitrocellulosemembraan aangebracht om respectievelijk de controlelijn en de testlijn te vormen. De membranen werden een nacht gedroogd bij kamertemperatuur. Ten slotte werden de LFIA-stroken in 4 mm brede stroken gesneden en tot gebruik bij 4°C bewaard.

Figuur 2

Ontwerp van laterale flow immunoassay (LFIA).

De sputummonsters werden verdund met lysisbuffer, en 100 μl van het voorbereide monster werd op het monsterkussen aangebracht. De geprepareerde strips werden gedurende 5-10 minuten horizontaal gelegd om het monster van het monsterkussentje naar het wattenschijfje te laten stromen. Het verschijnen van een roodachtige kleur op de testlijn en de controlelijn werd waargenomen.

2.6. Conventionele Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Test

Om de positiviteit en negativiteit van de monsters in vergelijking met de door ons ontwikkelde LFIA te bevestigen, werd een semikwantitatieve ELISA-test gedaan. Daartoe werden ELISA-platen met 96 putjes gecoat met 100 μl konijn anti-M. tuberculosis antilichaam met een concentratie van 1 μg/ml in carbonaatbuffer. De ELISA-plaat werd afgedekt met parafilm en gedurende 2 uur geïncubeerd. Vervolgens werd elk gecoat putje driemaal gewassen door de putjes te vullen met wasbuffer die PBS en Tween-20 bevatte. Alle oplossingen werden verwijderd door de plaat 2-3 keer om te draaien om ongebonden eiwit te verwijderen. Na de wasstap werd de ELISA-plaat geblokkeerd door toevoeging van 250 μl blokkeerbuffer (PBS en BSA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De ELISA-plaat werd nogmaals 3 keer gewassen met wasbuffer en 100 μl van verschillende concentraties CFP10-ESAT6-antigeen van M. tuberculosis in antilichaamverdunningsbuffer die PBS, Tween-20 en BSA bevatte, werd toegevoegd aan elk putje. Alle antigeen werd in drievoud getest en overnacht geïncubeerd bij 4°C. Na incubatie van het antigeen werd de plaat opnieuw 3 keer gewassen met behulp van wasbuffer en werd 100 μl konijn anti-M. tuberculosis HRP-conjugaat toegevoegd in elk putje gedurende 1 uur, gevolgd door de wasstap en de toevoeging van TMB-substraatoplossing. Er verschijnt een blauwe kleur die wijst op de aanwezigheid van gelabeld detectieantilichaam met complementantilichaam-antigeenbinding. Tenslotte werd 100 μl stopoplossing (0,5 M H2SO4) toegevoegd en de aflezing van de extinctie werd verkregen met behulp van een ELISA-microplaatlezer.

3. Resultaten en discussie

3.1. Om het detectiemechanisme van de sandwichstrategie verder uit te leggen en de specifieke rol van de gebruikte antilichamen te evalueren, werden controle-experimenten uitgevoerd. ELISA-analyse werd gebruikt om de binding van antilichaam en antigeen op de testlijn te verifiëren, zoals getoond in figuur 3.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 3

(a) Detectie van CFP10-ESAT6 met behulp van conventionele ELISA-methode met illustratie van bindend antilichaam-antigeencomplex met gelabeld detectieantilichaam in sandwichvorm. Negatieve controles (zonder antigeen) tonen aan dat er geen kleur verschijnt in well 3, terwijl wells met antigeen een blauwgekleurd signaal vertonen. (b) Detectie van CFP10-ESAT6 met behulp van ons ontwikkelde LFIA-platform met afbeelding van bindend antilichaam-antigeencomplex in sandwichvorm. Twee gekleurde lijnen geven de aanwezigheid van antigeen aan, terwijl één gekleurde lijn geen antigeendetectie aangeeft.

Detectieantilichaam werd gelabeld met HRP-enzym dat een gekleurd signaal zal induceren wanneer TMB werd toegevoegd. Het ELISA-sandwichcomplex werd gevormd, dat het vangstantilichaam, het antigeen en het detectieantilichaam omvat (figuur 3(a)). Zoals te zien is in figuur 3(a), vertoont de controleput geen kleursignaal aangezien de afwezigheid van antigeen geen binding van het gelabelde detectieantilichaam veroorzaakt. De ELISA-plaat vertoont een blauw signaal in de wells met antigeen en er kan geen blauw signaal worden waargenomen in afwezigheid van antigeen. De resultaten bevestigden dat het fusie-eiwit CFP10-ESAT6 een geweldig kandidaat-antigeen is met een hoge specificiteit voor de geselecteerde antilichamen die in dit werk zijn gebruikt op basis van het sandwichformaat voor immunodiagnose in ELISA.

Hoewel ELISA een effectieve methode laat zien voor de bepaling van CFP10-ESAT6 in M. tuberculosis, kunnen omslachtige wasprocedures en vereiste antilichaamlabeling het brede gebruik van deze methode voor eenvoudige en snelle detectie van TB beperken. Daarom hebben wij in deze studie een eenvoudig, draagbaar, gebruiksvriendelijk en snel platform opgezet voor de bepaling van het anti-CFP10-ESAT6-antilichaam voor TB-diagnose op basis van LFIA in sandwich-testformaat, zoals weergegeven in figuur 3(b). Het gebruik van AuNPs maakt een roodachtige kleurwaarneming mogelijk. Een positief resultaat wijst bij waarneming op zowel een gekleurde testlijn als een gekleurde controlelijn, terwijl een waarneming van een enkele gekleurde controlelijn wijst op een negatief resultaat. Het huidige lateral flow apparaat toont belofte voor gebruik in toepassingen waar AuNPs hechten door specifieke biologische herkenningsgebeurtenissen (doel-bindende configuratie) wanneer de doelanalyt (CFP10-ESAT6) aanwezig is.

3.2. De gesynthetiseerde AuNPs werden gekarakteriseerd met behulp van UV-Vis en HRTEM om de golflengte van de maximale absorptie () te verkrijgen en om de morfologie van AuNPs te bepalen die zijn gesynthetiseerd door citraatreductie methode, respectievelijk. Op basis van figuur 4(a), absorbeert het deeltje van AuNPs licht bij een absorptie van 520 nm als gevolg van de oppervlakte plasmon resonantie. Het HRTEM beeld getoond in figuur 4 (b) geeft een duidelijk beeld van bolvormige AuNPs minder geaggregeerd met elkaar, en de gemiddelde grootte van AuNPs verkregen is ongeveer ~ 30 nm zoals afgebeeld in figuur 4 (c).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 4

Karakterisering van gesynthetiseerde AuNPs. (a) UV-zichtbaar absorptiespectrum. (b) HRTEM beeld van AuNPs. (c) Histogram beeld van nanodeeltjes grootte.

De AuNP labeling aanpak werd gebruikt als een snelle detectie van M. tuberculosis met behulp van laterale flow strips. AuNPs die werden geconjugeerd met konijn anti-M. tuberculosis antilichaam werden geoptimaliseerd om een stabiele robijnrode kleur te krijgen voor verschijning als signaal in de testlijn en de controlelijn. De stabiliteit van de goudkolloïd werd onderzocht aan de hand van de absorptie van de colloïd na toevoeging van verschillende concentraties antilichaam. De optimale concentratie van het stabiliserende antilichaam werd bepaald door verschillende concentraties van het antilichaam te gebruiken. Voor de conjugatie worden de antilichamen aan het AuNP-oppervlak gehecht door fysische en chemische interacties. Het antilichaam wordt niet-specifiek geadsorbeerd aan AuNPs terwijl de stabiliteit in colloïdale oplossing werd geleverd door de negatief geladen nanodeeltjes . De stabiliteit van de gouden colloïde werd onderzocht aan de hand van de absorptie van de colloïde na toevoeging van verschillende concentraties antilichaam.

Figuur 5(a) toont de kleurveranderingen van AuNP oplossing met antilichaam met verschillende concentraties. De kleur van de oplossing veranderde van rood naar blauw na toevoeging van een lage concentratie konijn anti-M. tuberculosis antilichaam in de aanwezigheid van NaCl. De rode kleur van AuNPs blijft in een stabiele toestand wanneer een hoge concentratie of overmaat aan antilichaam werd toegevoegd. De minimumconcentratie van antilichaam om het colloïdale goud te stabiliseren was ongeveer 10 μg/ml zoals getoond in figuur 5(b). Bij 10 ug antilichaam per 1 ml goudoplossing was het antilichaam voldoende gebonden aan AuNPs. Meer eiwit gebonden aan de AuNPs als de concentratie van antilichaam te verhogen, waarin alle van de beschikbare bindingsplaatsen bezet waren. Figuur 5(c) toont de UV-Vis absorptiespectra van verschillende concentraties van antilichaam geconjugeerd met AuNP oplossing. De maximale SPR absorptie voor oplossingen 1 tot 8 (van hoge concentratie antilichamen) toont ongeveer bij 550 nm, terwijl oplossingen 9 tot 11 (lagere concentratie antilichamen) tonen lange golflengte verschoven bij 570 nm. Dit is te wijten aan de aggregatie van AuNPs getoond in oplossingen 9 tot 11.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 5

Karakterisering van gesynthetiseerde AuNPs geconjugeerd met antilichaam. (a) Een serie van verschillende concentraties van antilichaam geconjugeerd met AuNP oplossing. (b) UV-Vis piek absorptie van conjugaat bij verschillende konijn anti-M. tuberculosis antilichaam concentraties. (c) UV-Vis piek van AuNPs geïncubeerd met verschillende concentraties van antilichamen.

3.3. Lateral Flow Immunoassay Characterization for Antigen-Antibody TB Detection

Test strips werden geconstrueerd zoals getoond in figuur 6. Er zijn drie hoofdelementen in een strook: een conjugaatkussen, een membraan en een absorberend kussen. Er werd gebruik gemaakt van een Whatman-membraan om de stroom van het monster vlot te laten verlopen. Het monster van het monsterkussen zal door het conjugaatkussen stromen tot aan het wattenschijfje. Het wattenkussen trok het monster over de test- en controlelijnen door het overtollige monster op te vangen. Het antilichaam geconjugeerd met AuNPs werd gedeponeerd op het conjugaatkussen. Het konijn anti-M. tuberculosis werd uitgelijnd op het membraan dat bekend stond als de testlijn. De andere lijn werd uitgelijnd met geit anti-rabbit IgG antilichaam en bekend als de controle lijn. Het antilichaam op de testlijn vangt het antigeen dat gebonden is aan het met AuNPs gelabelde antilichaam. Als gevolg hiervan kon op de testlijn een roodachtige signaalkleur worden waargenomen. Het konijn IgG-antilichaam op de controlelijn vangt het resterende met AuNP’s gelabelde antilichaam op en kan als validatietest altijd een signaal vertonen.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 6

(a) De LFIA-strips vertonen een roodgekleurd signaal dat alleen op de controlelijn verschijnt wanneer het controlemonster (bufferoplossing zonder antigeen) gedurende 5- tot 10 minuten wordt geladen.10 min. (b) Roodachtige signalen verschenen zowel op de testlijn als op de controlelijn die wijzen op een positief signaal wanneer sputummonsters van TB-positieve patiënten 1 tot 4 op het monsterkussen werden gedoseerd.

De controlelijn op het nitrocellulosemembraan werd zodanig geoptimaliseerd dat een duidelijk roodachtig signaal met het blote oog kon worden waargenomen. De teststroken werden getest met lysisbuffer (geen antigeen), en de buffer werd zijdelings op het nitrocellulosemembraan laten stromen. Het roodachtige signaal op de controlelijn kan met het blote oog worden waargenomen zoals aangegeven in figuur 6(a) na 5-10 minuten bufferlading. Bij het testen van de laterale flow strips met een klinisch monster van patiënten met positieve TB, 100 ul van de oplossing werd gedoseerd op het monster pad. Zoals blijkt uit figuur 6 (b), kan een roodachtig signaal worden waargenomen op de testlijn en de controlelijn. Dit resultaat geeft aan dat het antilichaam op de testlijn zich met succes heeft gebonden aan het CFP10-ESAT6-antigeen in het sputummonster.

De ontwikkelde LFIA is verder getest met verschillende typen antigeen om de specificiteit van de strips te verifiëren. De testlijn van elke strip die met het antilichaam is afgevlakt, werd geobserveerd na 5-10 min nadat elk doelwit van het monsterkussen naar het uitwrijfkussen was gestroomd. Zoals te zien is in figuur 7, verscheen het signaal op de testlijn van de strook wanneer na 10 min. sputummonster werd geladen. Ondertussen, werd geen signaal waargenomen op de testlijn van de controlestrook, die op de afwezigheid van om het even welk doel van de steekproef wijst. De resultaten tonen het specifieke doelwit van het antilichaam op de testlijn aan wanneer er geen signaal te zien was op de testlijn wanneer het recombinante M. tuberculosis immunogene eiwit MPT64 antigeen en humaan serumalbumine op de strips werden getest. De ontwikkelde LFIA detecteert dus specifiek het sputummonster dat CFP10-ESAT6 bevat en het antilichaam op de testlijn vangt alleen het specifieke doel van het monster op.

Figuur 7

Specifieke detectie van sputummonster met behulp van LFIA. De detectie van CFP10-ESAT6 in sputummonster werd waargenomen als een roodachtige kleur op de testlijn van de strips, terwijl er geen signaal werd gedetecteerd op de testlijn van een ander doelwit.

3.4. Reproduceerbaarheidsonderzoek

Het reproduceerbaarheidsonderzoek van de ontwikkelde LFIA-strips is uitgevoerd door voor elke patiënt met klinisch sputummonster drie strips uit dezelfde batch te bereiden. Op basis van figuur 8 is elk sputummonster van verschillende TB-positieve patiënten (1-5) en TB-negatieve patiënt (6) getest op LFIA-strips en zijn de resultaten waargenomen nadat de sputummonsters op het monsterkussen waren geladen. De resultaten op elke strip laten zien dat zowel de testlijn als de controlelijn na 5-10 minuten een signaal vertonen. Het CFP10-ESAT6-antigeen van M. tuberculosis uit het klinische sputummonster van TB-patiënten werd dus gedetecteerd door het antilichaam op elke testlijn van de strips. Deze resultaten suggereren dat de precisie van elke strip werd beoordeeld door willekeurig LFIA te kiezen voor detectie van het analytmonster. Om verder te verifiëren dat de kleurverandering het gevolg is van de aanhechting van het complementaire doelantilichaam aan het vangstantilichaam op de ontwikkelde LFIA-strip, werd een extra test uitgevoerd met het sputummonster van een TB-negatieve patiënt (patiënt 6). Nadat het monster gedurende 5-10 minuten op het samplekussentje van de strip was geladen, vertoonde de test geen significante kleurverandering op de testlijn in vergelijking met de controlelijn, wat wijst op de afwezigheid van niet-specifieke binding van doelantigeen aan het capture antilichaam op de testlijnzone. Dit bewijst dat kleurdetectie plaatsvond door de binding van complementair doelantigeen van M. tuberculosis met antilichaam gefunctionaliseerd op de ontwikkelde LFIA strip.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figuur 8

De reproduceerbaarheidsstudie van LFIA-strips voor de detectie van CFP10-ESAT6-antigeen uit sputummonsters van TB-patiënten. (a) analyse voor sputummonster van patiënt 1, (b) analyse voor sputummonster van patiënt 2, (c) analyse voor sputummonster van patiënt 3, (d) analyse voor sputummonster van patiënt 4, (e) analyse voor sputummonster van patiënt 5, en (f) analyse voor sputummonster van patiënt 6.

4. Conclusies

Wij toonden een snelle, eenvoudige, en betaalbare methode op basis van LFIA voor ultrasensitieve blote oog detectie systeem van TB. De CFP10-ESAT6 detectie met behulp van sandwich-formaat procedure gepresenteerd in deze nieuw ontwikkelde immunosensor toont een eenvoudig en gemakkelijk platform dat een snelle alternatieve strategie kan bieden met het potentieel om te worden gebruikt in TB-diagnose in vergelijking met de ELISA-methode. De ontwikkelde sandwich immunoassay toonde een uitzonderlijke detectie respons ten opzichte van CFP10-ESAT6 in sputum specimen voor klinische monstertoepassing en toonde een hoge gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid als disposable-based sensor. Deze strip-gebaseerde immunoassay zou een groot potentieel kunnen bieden in goedkope en POC-toepassing voor TB-diagnose.

Data Availability

De gegevens die worden gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn opgenomen in het artikel.

Conflicts of Interest

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

De auteurs willen graag het ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië en Universiti Putra Malaysia bedanken voor de financiële steun via het Malaysia Research University Network (MRUN)-Universiti Putra Malaysia (UPM) (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230). Speciale dank gaat ook uit naar Siti Suraiya van HUSM Kubang Kerian, Kelantan, voor hulp bij het testen van echte monsters.