Lateral Flow Immunoassay for Naked Eye Detection of Mycobacterium tuberculosis

Abstract

結核はMycobacterium tuberculosisが引き起こす感染症であり、この結核の感染症対策として、結核菌の増殖を抑制するために、結核菌の増殖を抑制するためのラテラルフローイミュノアッセイが提案されています。 感染症の検出と制御は，特に発展途上国において大きな問題である。 ラテラルフローイミュノアッセイ（LFIA）は、結核を自動検出するためのハンドヘルド型イミュノアッセイベースのポイントオブケアプラットフォームとして導入されました。 結核菌のCFP10-ESAT6抗原をターゲットとして、LFIAストリップベースのPOC戦略を用いた結核の早期検出を行った。 光信号に基づく興味深いプラットフォームは、肉眼で見える検出領域の色変化として実装されています。 金ナノ粒子（AuNP）は、関心のあるターゲットの検出のための色プローブとして使用されました。 高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）画像と紫外可視分光光度計（UV-Vis）分析により、合成したAuNPが設計したイムノアッセイに適切であることが確認されました。 このプラットフォームは、結核菌の抗原を捕捉するための抗体（Ab）を結合したAuNPsから構成されています。 毛細管現象により、AuNP-Ab-抗原のサンドイッチ免疫反応がイムノストリップのテストパッド上で行われ、短いアッセイ時間でストリップのテストライン上のカラーシグナルにより観察することができる。 さらに、今回開発したバイオセンサーをヒト喀痰中のCFP10-ESAT6抗原検出に利用したところ、満足のいく結果が得られた。 さらに、開発したバイオセンサーをヒト喀痰中のCFP10-ESAT6抗原の検出に使用したところ、良好な結果が得られました。 本システムは、喀痰を用いた非侵襲的な診断システムであるため、開発途上国においてユーザーフレンドリーで安価な診断検査を提供できる可能性がある。 はじめに

結核は最も致命的な感染症の1つであり、世界中で重要な公衆衛生問題となっています。 この病気は主に結核菌の感染によって引き起こされ、結核感染者の咳やくしゃみ、あるいは会話などの微小なエアロゾル飛沫を介して感染する。 この空気感染する伝染病は、毎年900万人以上の新しい患者を生み出し、結核はヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染に次ぐ死因となっている。 結核の高い有病率の主な理由は、効果的な診断方法への不十分なアクセスや、肺結核のすべての感染症例を適時に治療することができないため、コミュニティ内で結核菌の感染が続いていることです。

現在の結核診断のゴールドスタンダードは痰の塗抹顕微鏡検査、胸の放射線検査、固体培養ですが、痰の塗抹顕微鏡検査と固体培養は、結核の感染症が発生する可能性があるため、結核の感染症が発生する可能性があります。 これらの方法は結核を診断することができるにもかかわらず、これらの検査は感度が悪く、特異度が低く、時間がかかるという制約がある 。 核酸増幅に基づくシステムが開発され、従来の技術よりも結核菌の感度、特異性が比較的向上し、迅速な検出が可能となった。 しかし、この方法は高水準の技術力と高コストの機器を必要とし、アッセイ性能を監視するための標準試薬を購入できる熟練した検査室でのみ使用されている . 結核は貧困の病であり、世界的な結核の負担の90％以上が低・中所得国で起こっていることから、資源に制約のある環境下で使用できる経済的な方法で、結核疾患を迅速、効率的、かつ正確に特定する信頼できる診断方法に対するアンメットニーズが存在する。

紙ベースのイムノアッセイは、迅速な検出、少量のサンプル、低コストなど、ポイントオブケア（POC）デバイスに必要な要件を達成し、資源が限られた地域でより多くの人々がコスト効率のよい医療を便利に受けられるようにしたことから、バイオセンシングにおいて高い関連性を持つ強力な技術であると言えます。 ペーパーベースのPOCイムノアッセイは、一般に、基材である紙、検出要素である抗体、シグナル伝達要素であるレポーター分子の3つの主要な要素で構成されています。 ラテラルフローイムノアッセイ（LFIA）は、ストリップベースバイオセンシングとしても知られ、現存するペーパーベースのプラットフォームの一つで、オンサイトおよびワンショットのセンサー（使い捨て）分析に最も適した戦略である。 電気化学的アプローチもラテラルフローストリップを利用していることは言及に値します。 しかし、LFIAにはいくつかの欠点があり、たとえば、分析物の濃度が低い場合、この技術は感度の点で問題が生じる可能性がある。

金ナノ粒子 (AuNP) などのナノ粒子 (NP) とさまざまな生体認識要素 (抗体、ペプチドアレイ、ポリマー、アプタマー) を組み込むことにより、検出システムの性能を高めるための有効なストラテジーがもたらされます。 AuNPを用いたペーパーバイオセンサーは、マラリア、B型肝炎ウイルス（HBV）、デング熱、エボラウイルス（EBOV）、その他のウイルスなど、様々な感染症診断のために最近集中的に研究され始めた。 その中で、比色法、蛍光法、電気化学法の3種類のペーパーベースイムノアッセイを実証してきた。 蛍光法と電気化学法は、感度の点では優れているが、多段階操作や検出時のリーダー依存性があり、エンドユーザーの利便性が低いという問題があった。 一方、比色法の利点は、低コスト、装置不要、迅速、肉眼で読める、現場でのハイスループット・スクリーニングに適していることであるが、精度、感度、定量性の向上が課題となっている。 また、結核の死亡率を下げ、結核の流行を防ぐためには、早期発見が重要であり、抗結核治療を適時に開始することが必要です。 そこで私たちは、結核の早期検出に適した結核菌の分泌タンパク質に着目しました。 その結果、10 kDaの培養濾液タンパク質（CFP10）と6 kDaの早期分泌抗原標的（ESAT6）は、それぞれRv3874とRv3875遺伝子によってコードされていることが判明した。 これらの遺伝子は、病原性結核菌ゲノムの相違点1（RD-1）領域に存在し、結核患者の70％以上で認識される強力なT細胞抗原である。 ESAT6とそのパートナーであるCFP10は、疎水性およびファンデルワールス相互作用により1：1の割合で強固に結合し、ESAT6-CFP10タンパク質複合体を形成しているという興味深い発見がなされた。 両タンパク質とも、複合体内では安定した完全な折りたたみ構造をとり、バックボーンの約3分の2は規則的ならせん構造になっている。 Meherらは、ESAT6-CFP10の複合体形成により、構造が変化し、熱力学的および生化学的安定性が向上し、リン脂質膜への結合が失われることを報告した。 このことは、ESAT6とCFP10が複合体として活性を持ち、転写因子などの制御タンパク質の活性をより厳密に制御することや、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-核酸相互作用の特異性を高める一般的なメカニズムなど、いくつかの機能的利点を与える可能性を示唆している . また、Renshawらの研究では、CFP10-ESAT6抗原の組み合わせにより、単一抗原に比べ診断能が向上することが示されている。 特に、ラベルとしてAuNPを組み込む戦略は、LFIAの視覚効果と応答強度を高める上で重要な役割を果たします。 図1に、今回開発した方法の設計と応答原理を示す。 抗体はLFIAの異なる位置に結合され、標的抗原を捕捉します。抗体に標識された着色検出試薬（AuNP）は、LFIAのテストゾーンとコントロールゾーンに着色反応を引き起こします。 この特徴的なカラーバンドにより、標的分析物を視覚的（肉眼）に検出することができます。 検出信号を増幅し、結核特異的バイオマーカーに対するセンサーの選択性を高めるために、サンドイッチ免疫測定法が使用されました。 テストラインとコントロールラインの両方が着色されている場合は陽性、コントロールラインが1色で着色されている場合は陰性と判定されます（図1（a））。 コントロールラインは、サンプル中の分析対象物の有無にかかわらず、サンプルが意図したとおりにメンブレンを通過したことを示す。 色付きの線が全く現れない場合は、無効な結果とみなされるため、試験をやり直す必要があります。

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図1

コロイド金をラベルとするラテラルフローテストストリップバイオセンサーに基づく検出原理の模式図である。 (a)2色の線の観察により結核菌が検出された陽性結果（結核感染者）。 (b)試料中に結核菌が存在しないことを示す陰性結果（健康な人）。 5421>

また、開発したLFIAが結核感染者の喀痰からCFP10-ESAT6を検出できることを実証した。 本研究により，喀痰中のバイオマーカー検出による血液検査不要の方法は，特にHIV陽性者における結核疾患の早期発見に有用であり，臨床分析への応用や周辺検査施設に頼らない家庭での利用が期待されることが示唆された。 Materials and Reagents

Polyclonal anti-CFP10 antibody, rabbit anti M. tuberculosis, rabbit anti-M. tuberculosis HRP conjugate, goat anti-rabbit IgG antibody, M. tuberculosis ESAT-6-like protein esxB (CFP-10), and recombinant M. tuberculosis immunogenic protein MPT64 antigens were purchased from Cusabio (Selangor, Malaysia).結核は、CusaBio社から購入した。 ウシ血清アルブミン（BSA）、ヒト血清、塩化金（III）三水和物、炭酸カリウム、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）錠剤、およびTween-20は、Sigma-Aldrich（米国ミズーリ州セント・ルイス）より購入した。 3,30,5,50-Tetramethylbenzidine (TMB) ELISA substrateとクエン酸ナトリウムは、それぞれAbcam (Cambridge, UK) とR&M Chemicals (Essex, UK) から入手した。 マレーシア、ケランタンのHospital Universiti Sains Malaysia（HUSM）の患者の喀痰サンプルは、識別番号TB1273/2017、B562423、TB541/2016、TB1304/2016、TB1280、およびSA217のものを使用した。 喀痰サンプルについては、HUSMの検査目的で使用された余剰サンプルのみであるため、同意の必要性を免除した。 また、本研究で使用したプロトコルは、マレーシア保健省の医学研究倫理委員会（MREC）の承認を得ている（承認番号：Approval Number: NMRR-17-3001-39473 (IIR))

2.2. 金ナノ粒子の合成

金ナノ粒子(AuNP)は、既報の通りクエン酸還元法により合成した. 塩化金を100mlの脱イオン水に溶解して塩化金溶液を調製し、調製した溶液を遮光して保存した。 次に、100mlの脱イオン水にクエン酸ナトリウムを溶解し、ろ過して、使用前のクエン酸ナトリウム溶液を新たに調製した。 塩化金酸溶液を沸騰するまで加熱し、クエン酸ナトリウムを一滴ずつ加えた。 10分後、フラスコをウォーターバスに入れ、少なくとも15分間冷却した。 その後、得られたAuNPを回収し、さらに使用するまで4℃の冷蔵庫で保管した。 合成されたAuNPsは、UV-VisおよびHRTEM画像を用いて特性評価された。 ウサギ抗M.結核抗体のAuNPsとの結合

ウサギ抗M.結核抗体のAuNPsとの結合は、わずかに変更を加えて以前に記載した方法に従って調製された。 簡単に言えば、6μlのウサギ抗M.結核抗体（12μg/ml）を5mlのコロイド金溶液に添加した。 使用前に、調製したAuNP溶液のpH値を、0.2M炭酸カリウムおよび0.1M塩酸を用いて8.0に調整した。 10分間攪拌した後、10%ウシ血清アルブミンを添加した。 この混合物を30分間インキュベートした後、4℃で一晩保存した。 その後、混合物を11,000 gで10分間遠心分離し、未反応の抗体を除去した。 ペレットを1/10オリジナルボリュームに相当する受動的希釈剤バッファー（PDB）で再懸濁させた。 光学密度（OD）の読みは、540nmでUV-Visを使用して調べ、.を得た。 最後に、AuNP溶液と結合した抗体を0.45μmのセルロースアセテートフィルターで濾過した

2.4. ニトロセルロース膜へのテストラインとコントロールラインのスポット

Rabbit IgG抗体をコントロールラインとしてニトロセルロース膜に1mg/mlの濃度で分注した。 Rabbit anti-M. tuberculosis antibodyを1mg/mlの濃度でテストラインとしてニトロセルロースメンブレンに分注した。 この抗体は、PBSバッファーと1％ショ糖で調製した。 ニトロセルロースメンブレンを室温で乾燥させ、4℃で保存した。 Lateral Flow Immunoassay Strips

LFIAストリップは、Kestrel Bio Sciences (Thailand) Co.から購入した。 LFIAの構造を図2に示す。 LFIAストリップは、バッキングカード上にサンプルパッド (Millipore C048, ), メンブレン (Whatman FF 60/100, ), ウィッキングパッド (Whatman 470, ) の3つのパッドが重なった構造になっている。 LFIAストリップは、バッキングカード上に1-2 mmのオーバーラップで順次組み立てた。 AuNP溶液と結合したウサギ抗M.結核菌抗体をコンジュゲートパッドに固定した（1mmあたり0.5μl）。 次に、ニトロセルロース膜にヤギ抗ウサギIgG抗体とウサギ抗M.Tuberculosis抗体をそれぞれ並べ、コントロールラインとテストラインを形成させた。 この膜を室温で一晩乾燥させた。 最後に、LFIAストリップを4mm幅にカットし、使用時まで4℃で保存した。

sputum sampleをlysis bufferで薄め、100μlをサンプルパッド上に準備し適用しました。 準備した短冊を水平に5～10分間置き、サンプルパッドからウィッキングパッドにサンプルが流れるようにした。 テストラインとコントロールラインに赤みがかった色の出現を確認した

2.6. 従来の酵素結合免疫吸着法（ELISA）試験

開発したLFIAとの比較で陽性・陰性を確認するため、半定量的ELISA試験を行った。 このため、ELISA用96ウェルプレートに、炭酸緩衝液で濃度1μg/mlのウサギ抗結核抗体を100μl塗布した。 ELISAプレートをパラフィルムで覆い、2時間インキュベートした後、PBSおよびTween-20を含む洗浄バッファーをウェルに満たすことにより、コーティングされた各ウェルを3回洗浄した。 すべての溶液は、プレートを2-3回フリックして、結合していないタンパク質を除去した。 洗浄工程の後、ELISAプレートを250μlのブロッキングバッファー（PBSおよびBSA）を加えることにより室温で30分間ブロックした。 ELISAプレートを洗浄バッファーで再度3回洗浄し、PBS、Tween-20、BSAを含む抗体希釈バッファー中の異なる濃度の結核菌CFP10-ESAT6抗原100μlを各ウェルに添加した。 すべての抗原は3連で試験され、4℃で一晩インキュベートされた。 抗原のインキュベーション後、プレートを洗浄液で3回洗浄し、100μlのウサギ抗結核菌HRP結合体を各ウェルに1時間かけて添加し、洗浄ステップとTMB基質溶液の添加を行いました。 青色を呈し、これは抗体と抗原の結合を補完する標識検出抗体の存在を示します。 最後に100μlの停止液（0.5M H2SO4）を加え、ELISA Microplate Readerで吸光度を測定しました。 結果と考察

3.1. 従来のELISA法を用いたサンドイッチ形式の検証

サンドイッチ戦略の感知メカニズムをさらに説明し、採用した抗体の特定の役割を評価するために、対照実験を行った。 図3に示すように、抗体と抗原の結合を確認するためにELISA分析を採用しました。

(a)

(b)

(a)
(b)

検出抗体はHRP酵素で標識されており、TMBを添加すると着色シグナルを誘発する。 捕捉抗体、抗原、および検出抗体を含むELISAサンドイッチ複合体を形成した（図3（a））。 図3(a)からわかるように、抗原がないと標識された検出抗体と結合しないため、コントロールウェルはカラーシグナルを示さない。 ELISA プレートでは、抗原が存在するウェルで青色シグナルを示し、抗原が存在しない場合は青色シグナルを観察することができません。 この結果から、融合タンパク質CFP10-ESAT6は、ELISA法における免疫診断サンドイッチフォーマットに基づき、本研究で使用した選択抗体に対して高い特異性を有する優れた候補抗原であることが確認された。 そこで、本研究では、図3（b）に示すように、LFIAに基づく結核診断用抗CFP10-ESAT6抗体のサンドイッチアッセイ形式による簡便、携帯、ユーザーフレンドリー、かつ迅速な測定プラットフォームを確立しました。 AuNPsを使用することで、赤色での観察が可能となります。 陽性は、試験ラインとコントロールラインの両方が着色していることを示し、コントロールラインが1色であることは、陰性であることを示す。 このラテラルフロー装置は、標的分析物（CFP10-ESAT6）が存在する場合、特定の生物学的認識イベント（標的結合構成）を通じてAuNPが付着するアプリケーションへの利用が期待できる。 金ナノ粒子と結合した抗体の特性評価

クエン酸還元法により合成したAuNPの最大吸光度の波長()と形態をそれぞれUV-VisとHRTEMを用いて特性評価を行った。 図4（a）から、AuNPsの粒子は表面プラズモン共鳴により520 nmの吸光度を持つ光を吸収することがわかった。 図4（b）に示すHRTEM画像は、互いに凝集の少ない球状のAuNPsの鮮明な画像を表しており、得られたAuNPsの平均サイズは図4（c）に示すように約〜30 nmであった。

(a)

(b)

(c)

(a)は、互いに凝集していない球状のAuNPを示す。
(a)
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(c)

AuNPラベル化アプローチは、ラテラルフローストリップを使用して結核菌の迅速な検出として使用されました。 ウサギ抗結核抗体を結合させたAuNPは、テストラインとコントロールラインでシグナルとして現れるために安定したルビーレッド色を得るように最適化された。 金コロイドの安定性は、異なる濃度の抗体を添加した後のコロイドの吸収から検討された。 最適な安定化抗体濃度は、異なる濃度の抗体を使用することで決定された。 コンジュゲーションのために、抗体は物理的および化学的相互作用によってAuNP表面に付着される . 抗体はAuNPに非特異的に吸着し、コロイド溶液中での安定性は負に帯電したナノ粒子によってもたらされた . 金コロイドの安定性は、異なる濃度の抗体を添加した後のコロイドの吸収から調べました。

図5 (a) は、異なる濃度の抗体を含むAuNP溶液の色の変化を示しています。 NaClの存在下で低濃度のウサギ抗M.結核抗体を添加した後、溶液の色は赤から青に変化した。 高濃度または過剰量の抗体を添加した場合、AuNPの赤色は安定した状態を維持した。 図5(b)に示すように、コロイド状金を安定化させるための抗体の最小濃度は約10μg/mlであった。 金溶液1mlあたり10μgの抗体で、抗体はAuNPsに十分に結合した。 抗体の濃度が高くなるにつれて、より多くのタンパク質がAuNPsに結合し、その中で利用可能な結合部位はすべて占有された。 図5(c) は、異なる濃度の抗体とAuNP溶液のUV-Vis 吸光スペクトルを示しています。 溶液1から8（高濃度抗体）のSPR吸収の最大値は約550 nmであるのに対し、溶液9から11（低濃度抗体）は570 nmで長波長シフトしていることがわかる。 これは、溶液9から11に見られるAuNPsの凝集によるものである。

(a)

(b)

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3.3. 抗原抗体結核検出のためのラテラルフローイムノアッセイ特性評価

テストストリップを図6に示すように構築した。 ストリップには3つの主要な要素がある：コンジュゲートパッド、メンブレン、および吸収パッドである。 膜は、サンプルの流れがスムーズになるようにWhatman膜を使用した。 サンプルパッドから出たサンプルは、コンジュゲートパッドを通ってウィッキングパッドまで流れる。 ウィッキングパッドは、余分なサンプルを捕捉することにより、テストラインとコントロールラインの上にサンプルを引き寄せます。 AuNPsと結合した抗体はコンジュゲートパッドに付着させた。 ウサギの抗結核菌は、テストラインであることが分かっているメンブレン上に配置された。 もう一方のラインは、ヤギ抗ウサギIgG抗体で整列させ、コントロールラインとした。 テストライン上の抗体は、AuNPで標識された抗体に結合した抗原を捕捉することができます。 その結果、テストライン上に赤色のシグナルが観察されました。 対照ライン上のウサギIgG抗体は、残りのAuNP標識抗体を捕捉し、検証テストとして常にシグナルを示すことができます。

(a)

(b)

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ニトロセルロース膜のコントロールラインは、赤っぽい信号がはっきりと肉眼で観察できるように最適化されていた。 テストストリップは溶解バッファ（抗原なし）によりテストされ、バッファはニトロセルロース膜上で横方向に流された。 バッファーを5-10分間流すと、肉眼で図6(a)のようにコントロールライン上の赤色シグナルが観察できるようになった。 結核陽性の患者の臨床サンプルでラテラルフローストリップをテストする際に、100μlの溶液をサンプルパッドに分注した。 図6(b)に示すように、テストラインとコントロールラインに赤色のシグナルが観察された。 この結果は、テストライン上の抗体が喀痰サンプル中のCFP10-ESAT6抗原と正常に結合したことを示しています。 また、開発したLFIAの特異性を確認するため、異なる種類の抗原を用いたテストを行った。 図7に示すように、10分後に喀痰サンプルをロードすると、ストリップのテストライン上にシグナルが出現した。 一方、対照ストリップのテストラインには信号が観測されず、これはサンプルのターゲットが存在しないことを示している。 また、リコンビナント結核菌免疫原タンパク質MPT64抗原とヒト血清アルブミンをテストしたところ、テストライン上にシグナルが観察されなかったことから、本抗体のターゲットが特異的であることが示された。 したがって、開発したLFIAはCFP10-ESAT6を含む喀痰試料を特異的に検出し、テストライン上の抗体はその試料の特異的標的のみを捕捉することができます。 喀痰サンプル中のCFP10-ESAT6の検出は、ストリップのテストライン上で赤色として観察され、別のターゲットのテストライン上ではシグナルが検出されませんでした

3.4. 再現性試験

開発したLFIAストリップの再現性試験は、臨床喀痰サンプル患者1人につき同一ロットのストリップを3枚作製して実施した。 図8に基づき、異なる結核陽性患者（1〜5）および結核陰性患者（6）の各喀痰サンプルをLFIAストリップで試験し、サンプルパッドに喀痰サンプルをロードした後、結果を観察した。 各ストリップの結果は、テストラインとコントロールラインの両方が5〜10分後に信号を呈することを示している。 したがって、結核患者の臨床喀痰試料に含まれる結核菌のCFP10-ESAT6抗原は、ストリップの各テストライン上の抗体によって検出されたことになる。 これらの結果から、分析対象試料を検出するためにLFIAをランダムに選択することにより、各ストリップの精度を評価することができたと考えられる。 さらに、色の変化が捕捉抗体への相補的な標的抗体の付着によるものであることを確認するために、結核陰性患者（患者6）の喀痰試料を用いた追加試験を実施した。 検体をストリップのサンプルパッドに5〜10分間ロードした後、テストラインではコントロールラインと比較して有意な色の変化が見られなかったことから、テストライン領域では標的抗原と捕捉抗体の非特異的結合がないことが示唆されました。 このことは、結核菌の相補的な標的抗原と開発したLFIAストリップ上の機能化抗体との結合により発色検出が行われることを証明するものである。

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4.結論

我々はLFIAに基づく結核の超高感度肉眼検出システムを迅速、簡便、安価に実現する方法を実証した。 サンドイッチ法によるCFP10-ESAT6検出は、ELISA法に代わる迅速な結核診断法として期待できる簡便な方法である。 開発したサンドイッチ免疫測定法は、臨床検体としての喀痰中のCFP10-ESAT6に対して優れた検出反応を示し、使い捨てセンサーとして高い感度、特異性、再現性を示しました。 このストリップ型イムノアッセイは、低コストで結核診断のためのPOCアプリケーションに大きな可能性をもたらすと考えられる。

謝辞

著者らは、マレーシア研究大学ネットワーク（MRUN）-プトラ大学（UPM）（UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230）を通じて財政支援を受けたマレーシア高等教育省およびプトラ大学マレーシアに感謝したい。 また、実際のサンプルテストに協力してくれたHUSM Kubang Kerian, KelantanのSiti Suraiyaに特別な感謝を捧げます

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