Saggio immunologico a flusso laterale per il rilevamento a occhio nudo del Mycobacterium tuberculosis
admin - Luglio 25, 2021Abstract
La tubercolosi (TB) è una malattia infettiva causata dal Mycobacterium tuberculosis. Il rilevamento e il controllo delle malattie infettive è un problema importante, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. L’immunodosaggio a flusso laterale (LFIA) è stato introdotto come una piattaforma palmare basata su immunodosaggio point-of-care per il rilevamento automatico della TBC. L’antigene CFP10-ESAT6 di M. tuberculosis è stato usato come bersaglio nella diagnosi precoce della TBC utilizzando la strategia POC basata su strisce LFIA. Un’interessante piattaforma basata su segnali ottici è implementata come un cambiamento di colore nell’area di rilevamento che è visibile a occhio nudo. Le nanoparticelle d’oro (AuNPs) sono state utilizzate come sonda di colore per il rilevamento di un target di interesse. L’immagine al microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) e l’analisi allo spettrofotometro ultravioletto-visibile (UV-Vis) hanno confermato che le AuNPs sintetizzate erano appropriate per l’immunosaggio progettato. La piattaforma consiste in AuNPs coniugate con anticorpi specifici (Ab) per catturare l’antigene di M. tuberculosis. Sotto l’effetto capillare, le immunoreazioni a sandwich di AuNP-Ab-antigene sono state eseguite sul test pad dell’immunostrip, che può essere osservato dal segnale di colore sulla linea di test della striscia con un breve tempo di dosaggio. Inoltre, il biosensore appena sviluppato è stato utilizzato nella rilevazione dell’antigene CFP10-ESAT6 in campioni di espettorato umano con risultati soddisfacenti. Le caratteristiche bande colorate permettono la rilevazione visiva (a occhio nudo) dell’analita target senza strumentazione. Questo sistema diagnostico non invasivo che è la rilevazione basata sull’espettorato potrebbe fornire test diagnostici facili da usare e accessibili nei paesi in via di sviluppo.
1. Introduzione
La tubercolosi (TB) è una delle malattie infettive più letali che è diventata un problema di salute pubblica significativo in tutto il mondo. La malattia è principalmente causata dall’infezione di Mycobacterium tuberculosis, che può essere trasmessa attraverso minuscole goccioline di aerosol come la tosse, starnuti, o anche parlando da una persona infetta TB. Questa malattia contagiosa aerea ha causato più di nove milioni di nuovi casi ogni anno, rendendo la TBC la seconda causa di morte dopo l’infezione da virus dell’immunodeficienza umana (HIV). Le ragioni principali per l’alto tasso di prevalenza della TBC includono l’accesso inadeguato a metodi diagnostici efficaci e l’incapacità di trattare tutti i casi infettivi di TBC polmonare in modo tempestivo, consentendo la trasmissione continua di M. tuberculosis all’interno delle comunità.
L’attuale gold standard per la diagnosi della TBC è la microscopia dello striscio di espettorato, la radiologia del torace e la coltura solida. Anche se i metodi sono in grado di diagnosticare la TBC, questi test sono limitati da una scarsa sensibilità, una bassa specificità e un processo che richiede tempo. I sistemi basati sull’amplificazione dell’acido nucleico sono stati sviluppati e offrono miglioramenti relativi in sensibilità, specificità e rilevamento rapido di M. tuberculosis rispetto alle tecniche convenzionali. Tuttavia, questo metodo richiede un alto livello di competenza tecnica e attrezzature ad alto costo e viene utilizzato solo in laboratori competenti che possono permettersi reagenti di riferimento per monitorare le prestazioni del test. Poiché la TBC è una malattia della povertà, in cui oltre il 90% del carico mondiale di TBC avviene in paesi a basso e medio reddito, c’è un bisogno insoddisfatto di metodi diagnostici affidabili per identificare la malattia TBC rapidamente, in modo efficiente e preciso in un modo economico da utilizzare in ambienti con risorse limitate.
Immunodosaggi basati su carta rappresentano una tecnica potente con grande rilevanza nel biosensing in quanto ha raggiunto i requisiti necessari per i dispositivi point-of-care (POC), tra cui la rilevazione rapida, una piccola quantità di campione, e basso costo in modo che più persone possono comodamente ricevere assistenza sanitaria a basso costo in aree con risorse limitate. I test immunologici POC basati su carta sono generalmente composti da tre componenti principali, cioè la carta come substrato, gli anticorpi come elemento di rilevamento e le molecole reporter come elemento di trasformazione del segnale. L’immunodosaggio a flusso laterale (LFIA), noto anche come biosensing basato sulla striscia, è una delle piattaforme esistenti basate sulla carta che rappresentano la strategia più favorevole per l’analisi on-site e one-shot sensor (monouso). Vale la pena ricordare che gli approcci elettrochimici stanno anche approfittando delle strisce a flusso laterale. Tuttavia, LFIA ha alcuni svantaggi; per esempio, a basse concentrazioni di analita, questa tecnologia può presentare problemi in termini di sensibilità.
L’incorporazione di nanoparticelle (NPs), come nanoparticelle d’oro (AuNPs) con diversi elementi di bioriconoscimento (anticorpi, array di peptidi, polimeri e aptamers), fornisce una strategia efficace per migliorare le prestazioni dei sistemi di rilevamento. Il biosensore di carta basato su AuNP ha avviato studi intensivi recentemente per la diagnosi di varie malattie infettive, come la malaria, il virus dell’epatite B (HBV), la dengue, il virus Ebola (EBOV) e altri virus. In questo contesto, sono stati dimostrati tre tipi di test immunologici basati sulla carta, tra cui test immunologici colorimetrici, basati sulla fluorescenza e basati sull’elettrochimica. Anche se i test immunologici basati sulla fluorescenza e elettrochimici mostrano meriti avanzati in termini di sensibilità, hanno anche coinvolto i problemi di funzionamento multistep e lettore-dipendente durante il rilevamento, che riduce la convenienza degli utenti finali. Nel frattempo, i vantaggi di colorimetrico basato immunoassay includono basso costo, senza attrezzature, rapido, leggibile ad occhio nudo, e adatto per high-throughput screening in loco, tuttavia, i miglioramenti nella precisione, sensibilità e quantificazione sono ancora le sue sfide.
Per quanto riguarda le piattaforme di rilevamento palmare per il POC, in particolare per la rilevazione di TB, colorimetrico basato LFIA sembra essere un buon inizio poiché questo metodo realizzato diagnostica rapida in condizioni di campo così come il funzionamento semplice. Inoltre, la rilevazione precoce è così critica per consentire l’inizio tempestivo del trattamento antitubercolare, che è la chiave per ridurre la mortalità e per evitare l’epidemia di TB. Per raggiungere questo obiettivo, ci siamo concentrati sulle proteine secretorie di M. tuberculosis adatte al rilevamento precoce della TB. La proteina del filtrato di coltura di 10 kDa (CFP10) e il target dell’antigene secreto precoce di 6 kDa (ESAT6) sono stati trovati codificati dai geni Rv3874 e Rv3875, rispettivamente. Questi geni si trovano nella regione della differenza-1 (RD-1) del genoma virulento di M. tuberculosis, che sono potenti antigeni delle cellule T riconosciuti in oltre il 70% dei pazienti affetti da TBC. Una scoperta entusiasmante è stata che ESAT6 e il suo partner proteico, CFP10, si legano strettamente tra loro in un rapporto di 1 : 1 attraverso interazioni idrofobiche e Van der Waals per formare un complesso proteico ESAT6-CFP10. Entrambe le proteine adottano una struttura stabile, completamente piegata nel complesso, con circa due terzi della spina dorsale in una conformazione elicoidale regolare. Meher e collaboratori hanno riferito che la formazione del complesso ESAT6-CFP10 ha portato a cambiamenti strutturali, maggiore termodinamica e stabilità biochimica, e perdita di legame alle membrane fosfolipidiche. Questo suggerisce che ESAT6 e CFP10 sono attivi come un complesso e possono conferire diversi vantaggi funzionali, tra cui un controllo più stretto dell’attività delle proteine di regolazione come i fattori di trascrizione, e un meccanismo generale per aumentare la specificità delle interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico. Inoltre, il lavoro riportato da Renshaw e collaboratori ha dimostrato che la combinazione di antigene CFP10-ESAT6 ha aumentato le prestazioni diagnostiche del test rispetto a un singolo antigene.
In questo lavoro, i meriti di LFIA e CFP10-ESAT6 come biomarcatore proteico di identificazione sono stati combinati, e per la prima volta, abbiamo sviluppato una striscia di test monouso basata su immunosaggio come un nuovo biosensore per la rilevazione rapida della TB utilizzando l’occhio nudo. Da notare che la strategia che ha incorporato AuNPs come etichetta gioca un ruolo cruciale nel migliorare l’effetto visivo e le intensità di risposta di LFIA. Il design e il principio di risposta di questo nuovo metodo sviluppato sono illustrati nella Figura 1. Gli anticorpi sono legati su diverse posizioni della LFIA per catturare gli antigeni bersaglio, e i reagenti colorati del rivelatore etichettati (AuNPs) sugli anticorpi danno le risposte colorate sulla zona di test e sulla zona di controllo della LFIA. Le caratteristiche bande colorate permettono la rilevazione visiva (a occhio nudo) dell’analita target. È stato utilizzato un formato di immunodosaggio a sandwich per amplificare il segnale di rilevamento e aumentare la selettività del sensore verso i biomarcatori specifici della TB. La comparsa di entrambe le linee di test e di controllo colorate indica un risultato positivo (Figura 1(a)), mentre l’osservazione di una sola linea di controllo colorata indica un risultato negativo (Figura 1(b)). La linea di controllo indica che il campione è migrato attraverso la membrana come previsto, indipendentemente dalla presenza o meno dell’analita nel campione. Se non appare alcuna linea colorata, viene considerato un risultato non valido; quindi, il test deve essere ripetuto.
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Abbiamo anche dimostrato l’efficacia della LFIA sviluppata per il rilevamento di CFP10-ESAT6 nell’espettorato, raccolto da campioni umani di persone infette da TB. Lo studio ha suggerito che il metodo senza test del sangue attraverso il rilevamento di biomarcatori nell’espettorato potrebbe essere di valore nella diagnosi precoce della malattia di TBC, soprattutto nei casi HIV-positivi, e quindi potrebbe fornire ampie applicazioni potenziali nell’analisi clinica e nell’uso a casa senza implementazione del laboratorio periferico.
2. Materiali e metodi
2.1. Materiali e reagenti
Corpo policlonale anti-CFP10, coniglio anti M. tuberculosis, coniglio anti-M. tuberculosis coniugato HRP, anticorpo di capra anti-coniglio IgG, proteina ESAT-6-like M. tuberculosis esxB (CFP-10), e proteina immunogenica ricombinante M. tuberculosis MPT64 antigeni sono stati acquistati da Cusabio (Selangor, Malaysia). L’albumina di siero bovino (BSA), il siero umano, il cloruro d’oro (III) triidrato, il carbonato di potassio, le compresse di fosfato salino (PBS) e il Tween-20 sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Il substrato ELISA 3,30,5,50-Tetrametilbenzidina (TMB) e il citrato di sodio sono stati ottenuti rispettivamente da Abcam (Cambridge, UK) e R&M Chemicals (Essex, UK). Sono stati utilizzati campioni di espettorato di pazienti dell’Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM), Kelantan, Malaysia, con numeri di identificazione TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280 e SA217. Per il campione di espettorato, si è rinunciato al consenso perché il campione di espettorato è solo un campione di avanzo che è stato utilizzato per scopi di laboratorio di HUSM. Inoltre, il protocollo utilizzato in questo studio è stato approvato dal Medical Research and Ethics Committee (MREC) del Ministry of Health Malaysia (Approval Number: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).
2.2. Sintesi delle nanoparticelle d’oro
Le nanoparticelle d’oro (AuNPs) sono state sintetizzate con il metodo della riduzione del citrato come precedentemente riportato. Una soluzione di cloruro d’oro è stata preparata sciogliendo il cloruro d’oro in 100 ml di acqua deionizzata, e la soluzione preparata è stata conservata al riparo dalla luce. Poi, una soluzione di citrato di sodio è stata preparata di fresco prima dell’uso sciogliendo un citrato di sodio in 100 ml di acqua deionizzata e filtrata. La soluzione di cloruro d’oro è stata riscaldata fino all’ebollizione della soluzione, e il citrato di sodio è stato aggiunto saggiamente goccia a goccia. Dopo 10 minuti, il pallone è stato messo in un bagno d’acqua per raffreddare per almeno 15 minuti. Le AuNPs risultanti sono state poi raccolte e conservate in frigorifero a 4°C fino a nuovo utilizzo. Le AuNPs sintetizzate sono state poi caratterizzate utilizzando UV-Vis e HRTEM image.
2.3. Coniugazione di coniglio Anti-M. tubercolosi anticorpo con AuNPs
Coniugazione di coniglio anti-M. tubercolosi anticorpo con AuNPs è stato preparato secondo i metodi descritti in precedenza con leggere modifiche. Brevemente, 6 μl di anticorpo di coniglio anti-M. tubercolosi (12 μg/ml) sono stati aggiunti a 5 ml di soluzione di oro colloidale. Prima dell’uso, il valore del pH della soluzione AuNP preparato è stato regolato a 8,0 utilizzando 0,2 M carbonato di potassio e 0,1 M HCl. La miscela è stata agitata per 10 min, ed è stato aggiunto il 10% di sieroalbumina bovina. La miscela è stata incubata per 30 minuti e conservata per una notte a 4°C. In seguito, la miscela è stata centrifugata per 10 minuti a 11.000 g per rimuovere gli anticorpi non coniugati. Il pellet è stato risospeso con un tampone diluente passivo (PDB) equivalente a 1/10 del volume originale. La lettura della densità ottica (OD) è stata studiata utilizzando UV-Vis a 540 nm per ottenere . Infine, l’anticorpo coniugato con la soluzione AuNP è stato filtrato attraverso un filtro di acetato di cellulosa da 0,45 μm.
2.4. Spotting della linea di test e della linea di controllo sulla membrana di nitrocellulosa
L’anticorpo IgG di coniglio è stato dispensato sulla membrana di nitrocellulosa come linea di controllo ad una concentrazione di 1 mg/ml. L’anticorpo di coniglio anti-M. tuberculosis ad una concentrazione di 1 mg/ml è stato distribuito su una membrana di nitrocellulosa come linea di controllo. L’anticorpo è stato preparato in tampone PBS e 1% di saccarosio. La membrana di nitrocellulosa è stata asciugata a temperatura ambiente e conservata a 4°C.
2.5. Le strisce LFIA sono state acquistate da Kestrel Bio Sciences (Thailandia) Co. La costruzione della LFIA è dimostrata nella Figura 2. La striscia LFIA è progettata con tre tamponi sovrapposti posti su una scheda di supporto: tampone campione (Millipore C048, ), membrana (Whatman FF 60/100, ) e tampone di assorbimento (Whatman 470, ). Le strisce LFIA sono state assemblate in sequenza sulla carta di supporto con una sovrapposizione di 1-2 mm. L’anticorpo di coniglio anti-M. tubercolosi coniugato con soluzione AuNP con è stato immobilizzato su un pad coniugato (0,5 μl per 1 mm). Il pad coniugato è stato asciugato a 37 ° C per 1 ora. Poi, capra anti-coniglio IgG anticorpo e coniglio anti-M. tubercolosi anticorpo sono stati allineati sulla membrana di nitrocellulosa per formare la linea di controllo e la linea di test, rispettivamente. Le membrane sono state asciugate a temperatura ambiente per una notte. Infine, le strisce LFIA sono state tagliate in strisce larghe 4 mm e conservate a 4°C fino all’utilizzo.
Figura 2
Progettazione del test immunologico a flusso laterale (LFIA).
I campioni di espettorato sono stati diluiti con tampone di lisi, e 100 μl del campione preparato sono stati applicati sul tampone del campione. Le strisce preparate sono state posizionate orizzontalmente per 5-10 minuti per permettere al campione di fluire dal tampone del campione al tampone di assorbimento. È stata osservata la comparsa di un colore rossastro sulla linea del test e sulla linea di controllo.
2.6. Test Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) convenzionale
Per confermare la positività e la negatività dei campioni rispetto al nostro LFIA sviluppato, è stato fatto un test ELISA semiquantitativo. A questo scopo, le piastre ELISA a 96 pozzetti sono state rivestite con 100 μl di anticorpo di coniglio anti-M. tuberculosis con una concentrazione di 1 μg/ml in tampone carbonato. La piastra ELISA è stata coperta con parafilm e incubata per 2 ore. Poi, ogni pozzetto rivestito è stato lavato 3 volte riempiendo i pozzetti con una soluzione di lavaggio contenente PBS e Tween-20. Tutte le soluzioni sono state rimosse sbattendo la piastra 2-3 volte per rimuovere qualsiasi proteina non legata. Dopo la fase di lavaggio, la piastra ELISA è stata bloccata aggiungendo 250 μl di tampone di bloccaggio (PBS e BSA) per 30 minuti a temperatura ambiente. La piastra ELISA è stata lavata di nuovo 3 volte con il tampone di lavaggio e ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 μl di diverse concentrazioni di antigene CFP10-ESAT6 del M. tuberculosis in tampone diluente per anticorpi contenente PBS, Tween-20 e BSA. Tutti gli antigeni sono stati testati in triplicato e incubati per una notte a 4°C. Dopo l’incubazione dell’antigene, la piastra è stata nuovamente lavata 3 volte utilizzando il tampone di lavaggio e 100 μl di coniugato di coniglio anti-M. tuberculosis HRP sono stati aggiunti in ogni pozzetto per 1 ora, seguita dalla fase di lavaggio e dall’aggiunta della soluzione di substrato TMB. Apparirà un colore blu che indica la presenza dell’anticorpo di rilevamento marcato con legame anticorpo-antigene. Infine, sono stati aggiunti 100 μl di soluzione di stop (0,5 M H2SO4) e la lettura dell’assorbanza è stata ottenuta utilizzando un lettore di micropiastre ELISA.
3. Risultati e discussione
3.1. Convalida del formato sandwich utilizzando la procedura ELISA convenzionale
Per spiegare ulteriormente il meccanismo di rilevamento della strategia sandwich e valutare i ruoli specifici degli anticorpi impiegati, sono stati condotti esperimenti di controllo. L’analisi ELISA è stata impiegata per verificare il legame dell’anticorpo e dell’antigene sulla linea di prova, come mostrato nella Figura 3.
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L’anticorpo di rilevazione è stato marcato con l’enzima HRP che induce un segnale colorato quando viene aggiunto il TMB. È stato formato il complesso ELISA sandwich, che comprende l’anticorpo di cattura, l’antigene e l’anticorpo di rilevazione (Figura 3(a)). Come si può vedere nella Figura 3(a), il pozzetto di controllo non mostra alcun segnale colorato poiché l’assenza di antigene non causerà alcun legame dell’anticorpo di rilevazione marcato. La piastra ELISA mostra il segnale blu nei pozzetti con antigene e nessun segnale blu può essere osservato in assenza di antigene. I risultati hanno confermato che la proteina di fusione CFP10-ESAT6 è stato un grande antigene candidato con alta specificità per gli anticorpi selezionati utilizzati in questo lavoro basato sul formato sandwich immunodiagnosi in ELISA.
Anche se ELISA mostra un metodo efficace per la determinazione di CFP10-ESAT6 in M. tuberculosis, procedure di lavaggio noioso e necessaria etichettatura anticorpo può limitare l’ampio uso di questo metodo per la rilevazione semplice e rapida di TB. Così, in questo studio presente, abbiamo stabilito un semplice, portatile, facile da usare e rapida piattaforma per la determinazione dell’anticorpo anti-CFP10-ESAT6 per la diagnosi di TB basato su LFIA in formato sandwich test, come mostrato nella Figura 3 (b). L’uso di AuNPs permette l’osservazione del colore rossastro. Un risultato positivo indica mediante osservazione sia una linea di test colorata che una linea di controllo colorata, mentre l’osservazione di una sola linea di controllo colorata indica un risultato negativo. L’attuale dispositivo di flusso laterale mostra la promessa per l’uso in applicazioni in cui AuNPs attaccano attraverso specifici eventi di riconoscimento biologico (configurazione di legame al bersaglio) quando l’analita target (CFP10-ESAT6) è presente.
3.2. Caratterizzazione dell’anticorpo coniugato con nanoparticelle d’oro
Le AuNPs sintetizzate sono state caratterizzate utilizzando UV-Vis e HRTEM per ottenere la lunghezza d’onda della massima assorbanza () e per determinare la morfologia delle AuNPs che sono state sintetizzate dal metodo di riduzione del citrato, rispettivamente. Sulla base della figura 4 (a), la particella di AuNPs assorbe la luce ad una assorbanza di 520 nm a causa della risonanza plasmonica di superficie. L’immagine HRTEM mostrato in Figura 4 (b) rappresenta una chiara immagine di AuNPs sferica meno aggregato con l’altro, e la dimensione media di AuNPs ottenuto è di circa ~ 30 nm come illustrato nella Figura 4 (c).
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L’approccio di etichettatura AuNP è stato utilizzato come rilevamento rapido di M. tuberculosis utilizzando strisce a flusso laterale. Le AuNP coniugate con l’anticorpo di coniglio anti-M. tuberculosis sono state ottimizzate per ottenere un colore rosso rubino stabile per apparire come segnale nella linea di test e in quella di controllo. La stabilità del colloide d’oro è stata esaminata dall’assorbimento del colloide dopo l’aggiunta di diverse concentrazioni di anticorpo. La concentrazione ottimale dell’anticorpo stabilizzante è stata determinata utilizzando diverse concentrazioni di anticorpo. Per la coniugazione, gli anticorpi sono attaccati alla superficie AuNP da interazioni fisiche e chimiche. L’anticorpo è adsorbito in modo non specifico su AuNPs mentre la stabilità in soluzione colloidale è stata fornita dalle nanoparticelle caricate negativamente. La stabilità del colloide d’oro è stata esaminata dall’assorbimento del colloide dopo l’aggiunta di diverse concentrazioni di anticorpo.
La figura 5(a) mostra i cambiamenti di colore della soluzione AuNP contenente anticorpo con diverse concentrazioni. Il colore della soluzione è cambiato da rosso a blu dopo l’aggiunta di una bassa concentrazione di anticorpo di coniglio anti-M. tuberculosis in presenza di NaCl. Il colore rosso delle AuNPs rimane in uno stato stabile quando viene aggiunta un’alta concentrazione o un eccesso di anticorpo. La concentrazione minima di anticorpo per stabilizzare l’oro colloidale era di circa 10 μg/ml come mostrato nella Figura 5(b). A 10 μg di anticorpo per 1 ml di soluzione di oro, l’anticorpo era adeguatamente legato a AuNPs. Più proteina legato al AuNPs come la concentrazione di aumento di anticorpo, in cui tutti i siti di legame disponibili sono stati occupati. Figura 5 (c) mostra gli spettri di assorbanza UV-Vis di diverse concentrazioni di anticorpo coniugato con soluzione AuNP. Il massimo assorbimento SPR per le soluzioni da 1 a 8 (da anticorpi ad alta concentrazione) mostra circa a 550 nm, mentre le soluzioni da 9 a 11 (anticorpi a bassa concentrazione) mostrano lunga lunghezza d’onda spostata a 570 nm. Ciò è dovuto all’aggregazione di AuNPs mostrato nelle soluzioni 9 a 11.
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3.3. Caratterizzazione del test immunologico a flusso laterale per la rilevazione dell’antigene-anticorpo TB
Le strisce di test sono state costruite come mostrato nella Figura 6. Ci sono tre elementi principali in una striscia: un tampone coniugato, una membrana e un tampone assorbente. La membrana Whatman è stata usata in modo che il flusso del campione scorra senza problemi. Il campione dal tampone del campione scorre attraverso il tampone coniugato fino al tampone di assorbimento. Il tampone di assorbimento ha tirato il campione sopra le linee di test e di controllo intrappolando il campione in eccesso. L’anticorpo coniugato con AuNPs è stato depositato sul pad coniugato. Il coniglio anti-M. tubercolosi è stato allineato sulla membrana che era nota per essere la linea di test. L’altra linea è stata allineata con l’anticorpo di capra anti-coniglio IgG e conosciuta come la linea di controllo. L’anticorpo sulla linea del test catturerà l’antigene che è stato legato all’anticorpo etichettato con AuNPs. Di conseguenza, il colore del segnale rossastro potrebbe essere osservato sulla linea di test. L’anticorpo IgG di coniglio sulla linea di controllo catturerà il restante anticorpo marcato con AuNP e potrebbe sempre mostrare il segnale come test di validazione.
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La linea di controllo sulla membrana di nitrocellulosa è stata ottimizzata in modo che un chiaro segnale rossastro potesse essere osservato a occhio nudo. Le strisce di controllo sono state testate con il tampone di lisi (senza antigene), e il tampone è stato lasciato scorrere lateralmente sulla membrana di nitrocellulosa. Il segnale rossastro sulla linea di controllo può essere osservato ad occhio nudo come mostrato nella Figura 6(a) dopo 5-10 minuti di caricamento del buffer. Dopo aver testato le strisce a flusso laterale con un campione clinico di pazienti con TB positiva, 100 μl di soluzione è stato erogato sul pad campione. Come mostrato nella Figura 6(b), un segnale rossastro potrebbe essere osservato sulla linea di test e sulla linea di controllo. Questo risultato indica che l’anticorpo sulla linea di test si è legato con successo all’antigene CFP10-ESAT6 nel campione di espettorato.
La LFIA sviluppata è stata ulteriormente testata con diversi tipi di antigene per verificare la specificità delle strisce. La linea di prova di ogni striscia che è stata macchiata con l’anticorpo è stata osservata dopo 5-10 minuti dopo che ogni bersaglio scorre dal tampone del campione al tampone di assorbimento. Come mostrato nella Figura 7, il segnale è apparso sulla linea di test della striscia quando il campione di espettorato è stato caricato dopo 10 minuti. Nel frattempo, nessun segnale è stato osservato sulla linea di prova della striscia di controllo, che indica l’assenza di qualsiasi bersaglio del campione. I risultati mostrano il bersaglio specifico dell’anticorpo sulla linea di test quando nessun segnale potrebbe essere visto sulla linea di test quando la proteina immunogenica ricombinante M. tuberculosis MPT64 antigene e albumina di siero umano sono stati testati sulle strisce. Pertanto, la LFIA sviluppata rileva specificamente il campione di espettorato che contiene CFP10-ESAT6 e l’anticorpo sulla linea del test cattura solo il bersaglio specifico del campione.
3.4. Studio di riproducibilità
Lo studio di riproducibilità delle strisce LFIA sviluppate è stato applicato preparando tre strisce dallo stesso lotto per ogni paziente campione di espettorato clinico. In base alla figura 8, ogni campione di espettorato di diversi pazienti positivi alla TBC (1-5) e negativi alla TBC (6) è stato testato sulle strisce LFIA e i risultati sono stati osservati dopo che i campioni di espettorato sono stati caricati sul tampone. I risultati su ogni striscia mostrano che sia la linea di test che quella di controllo presentano un segnale dopo 5-10 minuti. Quindi, l’antigene CFP10-ESAT6 di M. tuberculosis dal campione di espettorato clinico dei pazienti affetti da TBC è stato rilevato dall’anticorpo su ciascuna linea di test delle strisce. Questi risultati hanno suggerito che la precisione di ogni striscia è stata valutata scegliendo a caso la LFIA per il rilevamento del campione di analita. Per verificare ulteriormente che il cambiamento di colore sia dovuto all’attaccamento dell’anticorpo target complementare all’anticorpo di cattura sulla striscia LFIA sviluppata, è stato impiegato un ulteriore test utilizzando il campione di espettorato di un paziente TB-negativo (paziente 6). Dopo aver caricato il campione sul tampone della striscia per 5-10 minuti, il test non ha mostrato alcun cambiamento di colore significativo sulla linea del test rispetto alla linea di controllo, suggerendo l’assenza di legame aspecifico dell’antigene target all’anticorpo di cattura sulla zona della linea del test. Questo dimostra che la rilevazione del colore è avvenuta tramite il legame dell’antigene bersaglio complementare di M. tuberculosis con l’anticorpo funzionalizzato sulla striscia LFIA sviluppata.
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4. Conclusioni
Abbiamo dimostrato un metodo rapido, semplice e conveniente basato su LFIA per un sistema di rilevamento ultrasensibile a occhio nudo della TB. La rilevazione di CFP10-ESAT6 utilizzando la procedura in formato sandwich presentata in questo immunosensore di nuova concezione mostra una piattaforma semplice e facile che può fornire una strategia alternativa rapida con il potenziale per essere utilizzata nella diagnosi della TBC rispetto al metodo ELISA. L’immunodosaggio a sandwich sviluppato ha mostrato un’eccezionale risposta di rilevamento verso CFP10-ESAT6 in campioni di espettorato per l’applicazione di campioni clinici e ha dimostrato un’alta sensibilità, specificità e riproducibilità come sensore monouso. Questo test immunologico basato su striscia potrebbe fornire un grande potenziale nell’applicazione a basso costo e POC per la diagnosi della TBC.
Data Availability
I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono inclusi nell’articolo.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non c’è alcun conflitto di interesse riguardo alla pubblicazione di questo articolo.
Riconoscimenti
Gli autori desiderano ringraziare il Ministero dell’Istruzione Superiore della Malesia e l’Universiti Putra Malaysia per il supporto finanziario attraverso il Malaysia Research University Network (MRUN)-Universiti Putra Malaysia (UPM) (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230). Un ringraziamento speciale va anche a Siti Suraiya della HUSM Kubang Kerian, Kelantan, per l’aiuto nei test sui campioni reali.
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