Lateral Flow Immunoassay a Mycobacterium tuberculosis szabad szemmel történő kimutatására
admin - július 25, 2021Abstract
A tuberkulózis (TBC) a Mycobacterium tuberculosis által okozott fertőző betegség. A fertőző betegségek felderítése és ellenőrzése jelentős probléma, különösen a fejlődő országokban. A Lateral flow immunoassay (LFIA) egy kézi immunoassay-alapú point-of-care platformként került bevezetésre a TBC automatizált kimutatására. Az M. tuberculosis CFP10-ESAT6 antigénjét használták célpontként a tuberkulózis korai kimutatására az LFIA-csíkon alapuló POC-stratégia alkalmazásával. Az optikai jeleken alapuló érdekes platformot a detektálási területen szabad szemmel látható színváltozásként valósították meg. Az arany nanorészecskéket (AuNP-k) használták színszondaként az érdeklődésre számot tartó célpont kimutatására. A nagyfelbontású transzmissziós elektronmikroszkópos (HRTEM) kép és az ultraibolya-látható spektrofotométeres (UV-Vis) elemzés megerősítette, hogy a szintetizált AuNP-k alkalmasak a tervezett immunpróbához. A platform specifikus antitestekkel (Ab) konjugált AuNP-kből áll az M. tuberculosis antigénjének befogására. A kapilláris hatás alatt az AuNP-Ab-antigén szendvics-immunreakciókat végeztek az immunostrip tesztlapján, ami rövid vizsgálati idővel a csík tesztvonalán megjelenő színjelből figyelhető meg. Továbbá az újonnan kifejlesztett bioszenzort kielégítő eredménnyel alkalmazták CFP10-ESAT6 antigén kimutatására humán köpetmintákban. A jellegzetes színes sávok lehetővé teszik a célanalit vizuális (szabad szemmel), műszer nélküli kimutatását. Ez a köpetalapú, nem invazív diagnosztikai rendszer felhasználóbarát és megfizethető diagnosztikai vizsgálatokat biztosíthat a fejlődő országokban.
1. Bevezetés
A tuberkulózis (TBC) az egyik leghalálosabb fertőző betegség, amely világszerte jelentős közegészségügyi problémává vált . A betegséget elsősorban a Mycobacterium tuberculosis fertőzése okozza, amely parányi aeroszolcseppek útján terjedhet, például köhögés, tüsszentés vagy akár egy fertőzött tbc-s személy által történő beszélgetés útján . Ez a levegőben terjedő fertőző betegség évente több mint kilencmillió új esetet okoz, így a TBC a második vezető halálozási ok a humán immundeficiencia vírus (HIV) fertőzés után . A tbc magas előfordulási arányának elsődleges okai közé tartozik a hatékony diagnosztikai módszerekhez való nem megfelelő hozzáférés és a tüdőtuberkulózis valamennyi fertőző esetének időben történő kezelésének képtelensége, ami lehetővé teszi az M. tuberculosis folyamatos terjedését a közösségeken belül.
A tbc diagnózisának jelenlegi arany standardja a köpetkenet mikroszkópia, a mellkasi radiológia és a szilárd tenyésztés . Bár ezek a módszerek alkalmasak a TBC diagnosztizálására, ezeket a vizsgálatokat korlátozza a gyenge érzékenység, az alacsony specificitás és az időigényes folyamat . Kifejlesztették a nukleinsav-amplifikáción alapuló rendszereket, amelyek a hagyományos technikákhoz képest relatív javulást kínálnak az M. tuberculosis érzékenységében, specificitásában és gyors kimutatásában. Ez a módszer azonban magas szintű technikai hozzáértést és nagy költségű berendezéseket igényel, és csak olyan gyakorlott laboratóriumokban alkalmazzák, amelyek megengedhetik maguknak a vizsgálat teljesítményének ellenőrzésére szolgáló referencia-reagenseket . Mivel a tuberkulózis a szegénység betegsége, és a tuberkulózis világméretű terhének több mint 90%-a az alacsony és közepes jövedelmű országokban fordul elő, kielégítetlen szükség van megbízható diagnosztikai módszerekre a tuberkulózis gyors, hatékony és pontos, gazdaságos módon történő azonosítására, amelyeket az erőforrás-korlátozott körülmények között lehet alkalmazni.
A papír alapú immunpróba nagy teljesítményű technikát képvisel, amely nagy jelentőséggel bír a bioérzékelésben, mivel elérte a point-of-care (POC) eszközökhöz szükséges követelményeket, beleértve a gyors kimutatást, a kis mennyiségű mintát és az alacsony költséget, így több ember kaphat kényelmesen költséghatékony egészségügyi ellátást a korlátozott erőforrásokkal rendelkező területeken . A papír alapú POC-immunpróbák általában három fő komponensből állnak, azaz a papírból mint szubsztrátból, az antitestekből mint detektáló elemből és a riportmolekulákból mint jelátalakító elemből. A laterális áramlásos immunoassay (LFIA), más néven csík alapú bioszenzorozás, az egyik létező papír alapú platform, amely a legkedvezőbb stratégiát képviseli a helyszíni és egyszeri szenzoros (eldobható) elemzéshez . Érdemes megemlíteni, hogy az elektrokémiai megközelítések is kihasználják az oldalirányú áramlási csíkok előnyeit . Az LFIA-nak azonban vannak hátrányai; például az analit alacsony koncentrációjánál ez a technológia problémákat okozhat az érzékenység tekintetében .
A nanorészecskék (NP-k), például arany nanorészecskék (AuNP-k) beépítése különböző biorekvenciós elemekkel (antitestek, peptidtömbök, polimerek és aptamerek) hatékony stratégiát jelent a detektáló rendszerek teljesítményének növelésére. Az AuNP-alapú papír bioszenzor a közelmúltban intenzív vizsgálatokat kezdeményezett különböző fertőző betegségek, például a malária , a hepatitis B vírus (HBV) , a dengue , az Ebola vírus (EBOV) és más vírusok diagnosztizálására. Ebben az összefüggésben háromféle papír alapú immunpróbát mutattak be, beleértve a kolorimetrikus alapú, fluoreszcencia alapú és elektrokémiai alapú immunpróbákat. Bár a fluoreszcencia-alapú és az elektrokémiai alapú immunoassay az érzékenység tekintetében fejlett érdemeket mutat, a kimutatás során a többlépcsős működés és az olvasófüggőség problémái is felmerültek, ami csökkenti a végfelhasználók kényelmét. Eközben a kolorimetrián alapuló immunoassay előnyei közé tartozik az alacsony költség, a berendezés nélküli, gyors, szabad szemmel leolvasható, és alkalmas a nagy áteresztőképességű helyszíni szűrésre; azonban a pontosság, az érzékenység és a mennyiségi meghatározás javítása még mindig kihívást jelent .
A POC kézi detektáló platformok tekintetében, különösen a TBC kimutatására, a kolorimetrián alapuló LFIA jó kezdetnek tűnik, mivel ez a módszer gyors diagnosztikát valósított meg terepi körülmények között, valamint egyszerű működést biztosít. Ezen túlmenően a korai felismerés kulcsfontosságú a tuberkulózis elleni kezelés időben történő megkezdéséhez, ami kulcsfontosságú a halálozás csökkentése és a tbc-járvány elkerülése szempontjából. Ennek érdekében a tuberkulózis korai kimutatására alkalmas M. tuberculosis szekréciós fehérjékre összpontosítottunk. Megállapítottuk, hogy az Rv3874 és az Rv3875 gének által kódolt 10 kDa méretű tenyésztési szűrletfehérjét (CFP10) és 6 kDa méretű korai szekretált antigén célfehérjét (ESAT6). Ezek a gének a virulens M. tuberculosis genomjának különbség-1 régiójában (RD-1) találhatók, amelyek a tuberkulózisos betegek több mint 70%-ában felismert erős T-sejt antigének. Izgalmas felfedezés volt, hogy az ESAT6 és fehérjepartnere, a CFP10 hidrofób és Van der Waals kölcsönhatások révén 1:1 arányban szorosan kötődnek egymáshoz, és így ESAT6-CFP10 fehérjekomplexet alkotnak. Mindkét fehérje stabil, teljesen összehajtott szerkezetet vesz fel a komplexben, a gerinc mintegy kétharmada szabályos helikális konformációban van. Meher és munkatársai arról számoltak be, hogy az ESAT6-CFP10 komplex kialakulása szerkezeti változásokat, fokozott termodinamikát és biokémiai stabilitást, valamint a foszfolipidmembránokhoz való kötődés elvesztését eredményezte . Ez arra utal, hogy az ESAT6 és a CFP10 komplexként aktív, és számos funkcionális előnyt biztosíthat, beleértve a szabályozó fehérjék, például a transzkripciós faktorok aktivitásának szorosabb szabályozását, valamint a fehérje-fehérje és fehérje-nukleinsav kölcsönhatások specificitásának növelésére szolgáló általános mechanizmust . Emellett a Renshaw és munkatársai által bejelentett munka kimutatta, hogy a CFP10-ESAT6 antigén kombinációja növelte a vizsgálat diagnosztikai teljesítményét az egyetlen antigénhez képest .
Ebben a munkában az LFIA és a CFP10-ESAT6 mint azonosító fehérje biomarker előnyeit kombináltuk, és először fejlesztettünk ki egy eldobható immunpróbán alapuló tesztcsíkot, mint új bioszenzort a tuberkulózis gyors kimutatására szabad szemmel . Figyelemre méltó, hogy az AuNP-ket jelölésként beépítő stratégia döntő szerepet játszik az LFIA vizuális hatásának és válaszintenzitásának fokozásában. Az újonnan kifejlesztett módszer felépítését és válaszadási elvét az 1. ábra szemlélteti. Az antitesteket az LFIA különböző pozícióihoz kötik a célantigének befogása érdekében, és az antitesteken megjelölt színes detektorreagensek (AuNP-k) adják a színes válaszokat az LFIA tesztzónáján és a kontrollzónán. A jellegzetes színes sávok lehetővé teszik a célanalit vizuális (szabad szemmel történő) kimutatását. Szendvics-immunpróba formátumot alkalmaztunk a kimutatási jel felerősítése, valamint a szenzor szelektivitásának növelése érdekében a TBC-specifikus biomarkerekkel szemben. Mindkét színes tesztsor és színes kontrollsor megjelenése pozitív eredményt jelez (1. ábra (a)), míg az egyetlen színes kontrollsor megfigyelése negatív eredményt jelez (1. ábra (b)). A kontrollvonal azt jelzi, hogy a minta rendeltetésszerűen vándorolt át a membránon, függetlenül attól, hogy az analit jelen van-e a mintában vagy sem. Ha egyáltalán nem jelenik meg színes vonal, az érvénytelen eredménynek minősül, ezért a vizsgálatot meg kell ismételni.
(a)
(b)
(a)
(b)
Bemutattuk a kifejlesztett LFIA hatékonyságát a CFP10-ESAT6 kimutatására is TBC-fertőzött személyek humán mintáiból gyűjtött köpetben. A vizsgálat azt sugallta, hogy a vérvizsgálat nélküli módszer a biomarkerek köpetből történő kimutatásán keresztül értékes lehet a tbc-betegség korai felismerésében, különösen a HIV-pozitív esetekben, és így széleskörű alkalmazási lehetőségeket biztosíthat a klinikai elemzésben és az otthoni használatban perifériás laboratóriumi bevezetés nélkül.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Vizsgálati módszerek és módszerek
2.1. Vizsgálati módszerek és módszerek
. Anyagok és reagensek
. Anyagok és reagensek
Poliklonális anti-CFP10 antitestet, nyúl anti-M. tuberculosis, nyúl anti-M. tuberculosis HRP konjugátumot, kecske anti-nyúl IgG antitestet, M. tuberculosis ESAT-6-szerű fehérje esxB (CFP-10) és rekombináns M. tuberculosis immunogén fehérje MPT64 antigéneket a Cusabio-tól (Selangor, Malajzia) vásároltuk. A szarvasmarha-szérumalbumin (BSA), humán szérum, arany(III)-klorid-trihidrát, kálium-karbonát, foszfát-pufferelt sóoldat (PBS) tabletták és Tween-20 a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) cégtől származott. A 3,30,5,50-tetrametilbenzidin (TMB) ELISA-szubsztrátot és a nátrium-citrátot az Abcam-tól (Cambridge, Egyesült Királyság), illetve az R&M Chemicals-tól (Essex, Egyesült Királyság) szereztük be. A malajziai Kelantanban található Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM) kórházból származó betegek TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280 és SA217 azonosítószámú köpetmintáit használtuk. A köpetminta esetében eltekintettek a beleegyezés szükségességétől, mivel a köpetminta csak a HUSM laboratóriumi célokra felhasznált maradék mintája. Ezenkívül az ebben a vizsgálatban alkalmazott protokollt a malajziai Egészségügyi Minisztérium Orvosi Kutatási és Etikai Bizottsága (MREC) jóváhagyta (jóváhagyási szám: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).
2.2. Arany nanorészecskék szintézise
Az arany nanorészecskéket (AuNPs) citrát redukciós módszerrel szintetizáltuk, ahogyan arról korábban beszámoltunk . Az arany-klorid oldatot arany-klorid 100 ml ionmentesített vízben való feloldásával készítettük, és az elkészített oldatot fénytől védve tároltuk. Ezután egy nátrium-citrát oldatot frissen készítettünk a felhasználás előtt nátrium-citrát 100 ml ionmentesített vízben való feloldásával és szűréssel. Az arany-klorid oldatot az oldat forrásáig melegítettük, és a nátrium-citrátot bölcsen cseppenként adtuk hozzá. 10 perc elteltével a lombikot vízfürdőbe helyeztük, hogy legalább 15 percig hűljön. A kapott AuNP-ket ezután összegyűjtöttük, és további felhasználásig 4°C-on hűtőszekrényben tároltuk. A szintetizált AuNP-ket ezután UV-Vis és HRTEM kép segítségével jellemeztük.
2.3. Nyúl M. tuberculosis ellenes antitest konjugálása AuNP-kkel
A nyúl M. tuberculosis ellenes antitest konjugálását AuNP-kkel a korábban leírt módszerek szerint, enyhe módosítással készítettük el. Röviden, 6 μl nyúl M. tuberkulózis elleni antitestet (12 μg/ml) adtunk 5 ml kolloid aranyoldathoz. A felhasználás előtt az elkészített AuNP-oldat pH-értékét 0,2 M kálium-karbonát és 0,1 M HCl segítségével 8,0-ra állítottuk be. Az elegyet 10 percig kevertettük, majd 10% szarvasmarha szérumalbumint adtunk hozzá. Az elegyet 30 percig inkubáltuk, majd egy éjszakán át 4°C-on tároltuk. Ezt követően az elegyet 10 percig 11 000 g-n centrifugáltuk, hogy eltávolítsuk a nem konjugált antitesteket. A pelletet az eredeti térfogat 1/10-ének megfelelő mennyiségű passzív hígító pufferrel (PDB) reszuszpendáltuk. Az optikai sűrűséget (OD) 540 nm-en UV-Vis segítségével vizsgáltuk, hogy megkapjuk . Végül az AuNP-vel konjugált antitest oldatot 0,45 μm-es cellulóz-acetát szűrőn keresztül szűrtük.
2.4. A tesztvonal és a kontrollvonal nitrocellulózmembránra történő foltozása
A nyúl IgG antitestet kontrollvonalként 1 mg/ml koncentrációban nitrocellulózmembránra adagoltuk. Nyúl M. tuberculosis elleni antitestet 1 mg/ml koncentrációban tesztvonalként nitrocellulózmembránra szórtuk. Az ellenanyagot PBS pufferben és 1% szacharózban készítettük. A nitrocellulózmembránt szobahőmérsékleten megszárítottuk és 4°C-on tároltuk.
2.5. Lateral Flow Immunoassay Strips
LFIA csíkokat vásároltunk a Kestrel Bio Sciences (Thailand) Co., Ltd.-től. Az LFIA felépítését a 2. ábra mutatja be. Az LFIA-csíkot úgy tervezték, hogy három egymást átfedő párnát helyeztek el egy hátlapra: mintapárna (Millipore C048, ), membrán (Whatman FF 60/100, ) és wicking-párna (Whatman 470, ). Az LFIA-csíkokat 1-2 mm-es átfedéssel egymás után helyeztük fel az alátétkártyára. Az AuNP oldattal konjugált nyúl M. tuberculosis ellenes antitestet egy konjugált párnára immobilizáltuk (0,5 μl/1 mm). A konjugált párnát 37 °C-on 1 órán át szárítottuk. Ezután a nitrocellulózmembránra kecske anti-nyúl IgG ellenanyagot és nyúl M. tuberkulózis ellenes antitestet sorakoztattunk fel a kontrollsor, illetve a tesztsor kialakításához. A membránokat szobahőmérsékleten egy éjszakán át szárítottuk. Végül az LFIA-csíkokat 4 mm széles csíkokra vágtuk, és felhasználásig 4°C-on tároltuk.
A köpetmintákat lízispufferrel hígítottuk, és az előkészített mintából 100 μl-t a mintalapra vittünk. Az előkészített csíkokat 5-10 percre vízszintesen helyeztük el, hogy a minta átfolyjon a mintalapról a nedvszívó lapra. Megfigyeltük a vöröses szín megjelenését a tesztvonalon és a kontrollvonalon.
2.6. Hagyományos enzimhez kötött immunoszorbens teszt (ELISA) vizsgálat
A minták pozitivitásának és negativitásának megerősítése érdekében az általunk kifejlesztett LFIA-val összehasonlítva, félkvantitatív ELISA tesztet végeztünk. Ebből a célból 96 lyukú ELISA-lemezeket 100 μl nyúl M. tuberculosis elleni antitesttel vontunk be, 1 μg/ml koncentrációban, karbonátos pufferben. Az ELISA-lemezt lefedtük parafóliával, és 2 órán át inkubáltuk. Ezután minden egyes bevont lyukat háromszor mostunk úgy, hogy a lyukakat PBS-t és Tween-20-at tartalmazó mosópufferrel töltöttük meg. Az összes oldatot a lemez 2-3-szoros átforgatásával távolítottuk el a nem kötött fehérje eltávolítása érdekében. A mosási lépés után az ELISA-lemezt 250 μl blokkoló puffer (PBS és BSA) hozzáadásával 30 percig szobahőmérsékleten blokkoltuk. Az ELISA-lemezt ismét 3-szor mostuk mosópufferrel, majd minden egyes mélyedésbe 100 μl M. tuberculosis CFP10-ESAT6 antigénjének különböző koncentrációit adtuk PBS-t, Tween-20-at és BSA-t tartalmazó antitesthígító pufferben. Minden antigént három példányban vizsgáltunk, és egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk. Az antigén inkubálása után a lemezt ismét háromszor mostuk mosópufferrel, majd 100 μl nyúl anti-M. tuberculosis HRP konjugátumot adtunk minden egyes mélyedésbe 1 órán keresztül, majd a mosási lépés és a TMB szubsztrátoldat hozzáadása következett. Kék szín jelenik meg, ami a jelölt detektáló antitest jelenlétét jelzi a komplement antitest-antigén kötődéssel. Végül 100 μl stop-oldatot (0,5 M H2SO4) adtunk hozzá, és az abszorbancia leolvasását ELISA mikrolemez olvasóval végeztük el.
3. Eredmények és megbeszélés
3.1. Eredmények és megbeszélés
3.1. Az ELISA mikrolemez olvasó. A szendvicsformátum validálása hagyományos ELISA-eljárással
A szendvicsstratégia érzékelési mechanizmusának további magyarázata és az alkalmazott antitestek specifikus szerepének értékelése érdekében kontrollkísérleteket végeztünk. ELISA-analízist alkalmaztunk az antitest és az antigén kötődésének ellenőrzésére a tesztvonalon, amint az a 3. ábrán látható.
(a)
(b)
(a)
(b)
A detektáló antitestet HRP enzimmel jelöltük, amely TMB hozzáadásakor színes jelet indukál. Kialakult az ELISA szendvicskomplex, amely tartalmazza a befogadó antitestet, az antigént és a detektáló antitestet (3. a) ábra). Amint a 3. a) ábrán látható, a kontroll mélyedés nem mutat színjelet, mivel az antigén hiányában a jelölt detektáló antitest nem kötődik. Az ELISA-lemez az antigént tartalmazó mélyedésekben kék jelet mutat, antigén hiányában pedig nem figyelhető meg kék jel. Az eredmények megerősítették, hogy a CFP10-ESAT6 fúziós fehérje nagyszerű jelölt antigén, amely nagy specificitással rendelkezik az ebben a munkában használt kiválasztott antitestek számára, az ELISA-ban alkalmazott immundiagnosztikai szendvics formátum alapján.
Noha az ELISA hatékony módszert mutat a CFP10-ESAT6 meghatározására az M. tuberculosisban, a fárasztó mosási eljárások és a szükséges antitest-jelölés korlátozhatja a módszer széles körű alkalmazását a TBC egyszerű és gyors kimutatására. Ezért ebben a tanulmányban egy egyszerű, hordozható, felhasználóbarát és gyors platformot hoztunk létre az anti-CFP10-ESAT6 antitest meghatározására a tuberkulózis diagnosztizálására LFIA alapján szendvicsvizsgálati formátumban, amint azt a 3. ábra (b) mutatja. Az AuNP-k használata lehetővé teszi a vöröses színű megfigyelést. A pozitív eredményt egy színes tesztvonal és egy színes kontrollvonal megfigyelése jelzi, míg az egyetlen színes kontrollvonal megfigyelése negatív eredményt jelez. A jelenlegi laterális áramlási eszköz ígéretesnek tűnik olyan alkalmazásokban való felhasználásra, ahol az AuNP-k specifikus biológiai felismerési eseményeken keresztül (target-kötési konfiguráció) kötődnek a célanalit (CFP10-ESAT6) jelenléte esetén.
3.2. Az AuNP-k a célanalit (CFP10-ESAT6) jelenlétében. Arany nanorészecskékkel konjugált antitestek jellemzése
A szintetizált AuNP-ket UV-Vis és HRTEM segítségével jellemeztük a maximális abszorbancia hullámhosszának () meghatározására, illetve a citrátredukciós módszerrel szintetizált AuNP-k morfológiájának meghatározására. A 4. a) ábra alapján az AuNPs részecskéi a felületi plazmon-rezonancia miatt 520 nm-es abszorbanciánál nyelik el a fényt. A 4(b) ábrán látható HRTEM-kép a gömb alakú, egymással kevésbé aggregált AuNP-k tiszta képét mutatja, és a kapott AuNP-k átlagos mérete körülbelül ~30 nm, amint az a 4(c) ábrán látható.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Az AuNP-jelöléses megközelítést az M. tuberculosis gyors kimutatására használtuk laterális áramlási csíkok segítségével. A nyúl M. tuberculosis elleni antitesttel konjugált AuNP-ket úgy optimalizáltuk, hogy stabil rubinvörös színt kapjunk, amely jelként jelenik meg a teszt- és a kontrollsoron. Az aranykolloid stabilitását a kolloid abszorpciójából vizsgáltuk különböző antitestkoncentrációk hozzáadása után. Az optimális stabilizáló antitestkoncentrációt különböző antitestkoncentrációk alkalmazásával határoztuk meg. A konjugáláshoz az antitestek fizikai és kémiai kölcsönhatások révén kapcsolódnak az AuNP felületéhez . Az antitest nem specifikusan adszorbeálódik az AuNP-ken, míg a kolloid oldatban a stabilitást a negatív töltésű nanorészecskék biztosították . Az aranykolloid stabilitását a kolloid abszorpciója alapján vizsgáltuk különböző koncentrációjú antitest hozzáadása után.
Az 5. a) ábra az antitestet tartalmazó AuNP oldat színváltozását mutatja különböző koncentrációkkal. Az oldat színe vörösről kékre változott a nyúl M. tuberculosis elleni antitest alacsony koncentrációjának NaCl jelenlétében történő hozzáadása után. Az AuNP-k vörös színe stabil állapotban maradt, amikor nagy koncentrációjú vagy többlet mennyiségű antitestet adtunk hozzá. Az antitest minimális koncentrációja a kolloid arany stabilizálásához körülbelül 10 μg/ml volt, amint azt az 5. b) ábra mutatja. 10 μg antitest 1 ml aranyoldatra vonatkoztatva az antitest megfelelően kötődött az AuNP-khez. Az antitest koncentrációjának növekedésével több fehérje kötődött az AuNP-khez, amelyben az összes rendelkezésre álló kötőhely foglalt volt. Az 5. (c) ábra az AuNP-oldattal konjugált antitest különböző koncentrációinak UV-Vis abszorbancia spektrumát mutatja. Az 1-8. oldatok (magas koncentrációjú antitestek) SPR-abszorpciós maximuma körülbelül 550 nm-nél, míg a 9-11. oldatok (alacsonyabb koncentrációjú antitestek) hosszú, 570 nm-nél eltolt hullámhosszúságot mutatnak. Ez a 9-11. oldatokban látható AuNP-k aggregációjának köszönhető.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. Laterális áramlású immunpróba jellemzése antigén-antitest TB kimutatására
A tesztcsíkokat a 6. ábrán látható módon építettük fel. A csíknak három fő eleme van: egy konjugált pad, egy membrán és egy abszorbens pad. Whatman-membránt használtunk, hogy a minta áramlása zavartalan legyen. A minta a mintapadról a minta a konjugált padon keresztül a nedvszívó padig áramlik. A nedvszívó párna a mintát a teszt- és a kontrollvonalak fölé húzta a felesleges minta csapdába ejtésével. Az AuNP-kkel konjugált antitestet a konjugált padra helyeztük. A nyúl M. tuberculosis elleni antitestet a membránra igazítottuk, amelyről tudtuk, hogy a tesztvonal. A másik vonalat kecske antinyúl IgG antitesttel igazítottuk, amelyet kontrollvonalként ismertünk. A tesztvonalon lévő antitest befogja az antigént, amely az AuNP-kkel jelölt antitesthez kötődött. Ennek eredményeként a tesztvonalon vöröses jelszínt lehetett megfigyelni. A kontrollvonalon lévő nyúl IgG antitest befogja a maradék AuNP-vel jelölt antitestet, és validációs tesztként mindig jelet mutathat.
(a)
(b)
(a)
(b)
A nitrocellulózmembránon lévő kontrollvonalat úgy optimalizálták, hogy szabad szemmel is jól látható vöröses színű jelet lehessen megfigyelni. A tesztcsíkokat lízispufferrel (antigén nélkül) teszteltük, és a puffert hagytuk oldalirányban a nitrocellulózmembránon folyni. A kontrollcsíkon a 6. a) ábrán látható vöröses jel szabad szemmel is megfigyelhető 5-10 perc pufferbetöltés után. A laterális áramlási csíkok tesztelésekor pozitív TBC-s betegek klinikai mintájával 100 μl oldatot adagoltunk a mintalapra. Amint az a 6. b) ábrán látható, a tesztvonalon és a kontrollvonalon vöröses jel volt megfigyelhető. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a tesztvonalon lévő antitest sikeresen kötődött a köpetmintában lévő CFP10-ESAT6 antigénhez.
A kifejlesztett LFIA-t tovább tesztelték különböző típusú antigénekkel a csíkok specificitásának ellenőrzése érdekében. Minden egyes csík tesztvonalát, amelyet az antitesttel szpotoltak le, 5-10 perc elteltével figyeltük meg, miután minden egyes célpont a mintatömbről a wicking padra áramlott. Amint a 7. ábra mutatja, a jel megjelent a csík tesztvonalán, amikor 10 perc elteltével köpetmintát töltöttek be. Eközben a kontrollcsík tesztvonalán nem volt megfigyelhető jel, ami azt jelzi, hogy a minta nem tartalmaz célpontot. Az eredmények az antitest specifikus célpontját mutatják a tesztvonalon, amikor a csíkon a rekombináns M. tuberculosis immunogén fehérje MPT64 antigén és humán szérumalbumin vizsgálatakor nem volt látható jel a tesztvonalon. Ezért a kifejlesztett LFIA specifikusan detektálja a CFP10-ESAT6-ot tartalmazó köpetmintát, és a tesztvonalon lévő antitest csak a minta specifikus célpontját rögzíti.
3.4. Vizsgálati eredmények. Reprodukálhatósági vizsgálat
A kifejlesztett LFIA-csíkok reprodukálhatósági vizsgálatát úgy alkalmaztuk, hogy minden egyes klinikai köpetmintás beteghez ugyanabból a tételből három csíkot készítettünk. A 8. ábra alapján a különböző TBC-pozitív (1-5) és TBC-negatív (6) betegektől származó köpetmintákat LFIA-csíkokon teszteltük, és az eredményeket a köpetminták mintatömbre történő betöltése után figyeltük meg. Az eredmények minden egyes csíkon azt mutatják, hogy mind a tesztvonal, mind a kontrollvonal 5-10 perc után jelet mutat. Ennélfogva a tuberkulózisos betegek klinikai köpetmintájából származó M. tuberculosis CFP10-ESAT6 antigénjét a csíkok minden tesztvonalán kimutatták az ellenanyaggal. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy az egyes csíkok pontosságát úgy értékelték, hogy véletlenszerűen választották ki az LFIA-t az analitminta kimutatására. Annak további igazolására, hogy a színváltozás a komplementer célantitestnek a kifejlesztett LFIA-csíkon lévő befogadó antitesthez való kapcsolódása miatt következik be, egy további vizsgálatot alkalmaztunk egy TB-negatív beteg (6. beteg) köpetmintájának felhasználásával. Miután a mintát 5-10 percig a csík mintalapjára töltöttük, a teszt nem mutatott szignifikáns színváltozást a tesztvonalon a kontrollvonalhoz képest, ami arra utal, hogy a célantigén nem kötődik nem specifikusan a befogadó antitesthez a tesztvonalon. Ez azt bizonyítja, hogy a színdetektálás az M. tuberculosis komplementer célantigénjének a kifejlesztett LFIA-csíkon funkcionalizált antitesthez való kötődése révén történt.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Következtetések
Egy gyors, egyszerű és megfizethető, LFIA-n alapuló módszert mutattunk be a tuberkulózis ultraérzékeny, szabad szemmel történő kimutatási rendszerére. Az újonnan kifejlesztett immunszenzorban bemutatott CFP10-ESAT6 szendvics formátumú eljárással történő kimutatása egyszerű és könnyű platformot mutat, amely az ELISA módszerrel összehasonlítva gyors alternatív stratégiát jelenthet, amely potenciálisan alkalmazható a TB diagnosztikában. A kifejlesztett szendvics-immunpróba kivételes kimutatási választ mutatott a CFP10-ESAT6-ra köpetmintában a klinikai mintákban, és magas érzékenységet, specificitást és reprodukálhatóságot mutatott, mint eldobható alapú szenzor. Ez a szalag-alapú immunoassay nagy lehetőséget biztosíthat az alacsony költségű és POC alkalmazásban a tuberkulózis diagnózisában.
Adatok elérhetősége
A tanulmány eredményeinek alátámasztására használt adatokat a cikk tartalmazza.
Érdekütközések
A szerzők kijelentik, hogy nincs érdekellentét a cikk közzétételével kapcsolatban.
Köszönet
A szerzők köszönetet mondanak a Malajziai Felsőoktatási Minisztériumnak és az Universiti Putra Malaysia-nak a Malaysia Research University Network (MRUN)-Universiti Putra Malaysia (UPM) (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230) által nyújtott pénzügyi támogatásért. Külön köszönet illeti Siti Suraiyát a HUSM Kubang Kerian, Kelantanból, aki segített a valós minták vizsgálatában.
Vélemény, hozzászólás?