Lateral Flow Immunoassay Mycobacterium tuberculosis -bakteerin havaitsemiseksi paljain silmin
admin - 25 heinäkuun, 2021Abstract
Tuberkuloosi (tuberkuloosi) on Mycobacterium tuberculosis -bakteerin aiheuttama tartuntatauti. Tartuntatautien toteaminen ja valvonta on suuri ongelma erityisesti kehitysmaissa. Sivuvirtausimmunomääritys (Lateral flow immunoassay, LFIA) on otettu käyttöön kädessä pidettävänä immunomääritykseen perustuvana point-of-care-alustana tuberkuloosin automaattista havaitsemista varten. M. tuberculosis -bakteerin CFP10-ESAT6-antigeeniä käytettiin kohteenaan tuberkuloosin varhaisessa havaitsemisessa LFIA-testiliuskaan perustuvalla POC-strategialla. Mielenkiintoinen optisiin signaaleihin perustuva alusta on toteutettu ilmaisualueen värimuutoksena, joka näkyy paljaalla silmällä. Kultaisia nanohiukkasia (AuNP) käytettiin värisondina kiinnostavan kohteen havaitsemisessa. Korkean resoluution transmissioelektronimikroskopiakuva (HRTEM) ja ultravioletti-violettispektrofotometrin (UV-Vis) analyysi vahvistivat, että syntetisoidut AuNP:t soveltuivat suunniteltuun immunomääritykseen. Alusta koostuu AuNP:istä, jotka on konjugoitu spesifisten vasta-aineiden (Ab) kanssa M. tuberculosis -antigeenin vangitsemiseksi. Kapillaarivaikutuksen vallitessa AuNP-Ab-antigeenin sandwich-immunoreaktiot suoritettiin immunoliuskan testialustalla, mikä voidaan havaita värisignaalista liuskan testiviivalla lyhyellä määritysajalla. Lisäksi äskettäin kehitettyä biosensoria käytettiin CFP10-ESAT6-antigeenin osoittamiseen ihmisen ysköksenäytteistä tyydyttävin tuloksin. Ominaisvärikaistat mahdollistavat kohdeanalyytin visuaalisen havaitsemisen (paljain silmin) ilman instrumentteja. Tämä ei-invasiivinen diagnoosijärjestelmä, joka perustuu ysköksiin, voisi tarjota käyttäjäystävällisiä ja edullisia diagnostisia testejä kehitysmaissa.
1. Johdanto
Tuberkuloosi (TB) on yksi tappavimmista tartuntataudeista, josta tuli merkittävä kansanterveysongelma maailmanlaajuisesti . Tauti johtuu pääasiassa Mycobacterium tuberculosis -bakteerin aiheuttamasta infektiosta, joka voi tarttua pienien aerosolipisaroiden välityksellä, kuten yskimällä, aivastelemalla tai jopa puhumalla tartunnan saaneen tuberkuloosia sairastavan henkilön toimesta . Tämä ilmateitse tarttuva tauti aiheuttaa vuosittain yli yhdeksän miljoonaa uutta tapausta, mikä tekee tuberkuloosista toiseksi yleisimmän kuolinsyyn ihmisen immuunikatovirustartunnan (HIV) jälkeen . Tärkeimpiä syitä tuberkuloosin suureen esiintyvyyteen ovat tehokkaiden diagnoosimenetelmien riittämätön saatavuus ja kyvyttömyys hoitaa kaikkia keuhkotuberkuloositapauksia ajoissa, mikä mahdollistaa M. tuberculosis -bakteerin jatkuvan leviämisen yhteisöissä.
Tuberkuloosin diagnosoinnin nykyinen kultainen standardi on ysköksen mikroskopointi, rintakehän röntgenkuvaus ja kiinteä viljely . Vaikka näillä menetelmillä pystytäänkin diagnosoimaan tuberkuloosi, näitä testejä rajoittavat heikko herkkyys, alhainen spesifisyys ja aikaa vievä prosessi . Nukleiinihappomonistukseen perustuvia järjestelmiä on kehitetty, ja ne tarjoavat suhteellisia parannuksia herkkyyteen, spesifisyyteen ja M. tuberculosis -bakteerin nopeaan havaitsemiseen verrattuna perinteisiin menetelmiin. Tämä menetelmä edellyttää kuitenkin korkeatasoista teknistä osaamista ja kalliita laitteita, ja sitä käytetään vain osaavissa laboratorioissa, joilla on varaa vertailureagensseihin määrityksen suorituskyvyn seuraamiseksi . Koska tuberkuloosi on köyhyyden aiheuttama sairaus, jossa yli 90 prosenttia maailmanlaajuisesta tuberkuloositaudista esiintyy matalan ja keskitulotason maissa, tarvitaan luotettavia diagnostisia menetelmiä, joilla tuberkuloosit voidaan tunnistaa nopeasti, tehokkaasti ja täsmällisesti ja taloudellisesti, jotta niitä voidaan käyttää resursseiltaan rajallisissa ympäristöissä.
Paperipohjaiset immunomääritykset edustavat tehokasta tekniikkaa, jolla on suuri merkitys biosensoinnissa, koska se saavutti hoitopaikan (POC) laitteille asetetut vaatimukset, mukaan lukien nopea havaitseminen, pieni näytemäärä ja alhaiset kustannukset, jotta useammat ihmiset voivat kätevästi saada kustannustehokasta terveydenhuoltoa resursseiltaan rajoitetuilla alueilla . Paperipohjaiset POC-immunomääritykset koostuvat yleensä kolmesta pääkomponentista, joita ovat paperi substraattina, vasta-aineet havaitsemiselementtinä ja reportterimolekyylit signaalia muuttavana elementtinä. Sivuvirtausimmunomääritys (Lateral flow immunoassay, LFIA), joka tunnetaan myös nimellä nauhapohjainen biosensointi, on yksi nykyisistä paperipohjaisista alustoista, jotka edustavat suotuisinta strategiaa paikan päällä tapahtuvaan ja kertakäyttöiseen (kertakäyttöiseen) sensorianalyysiin. On syytä mainita, että myös sähkökemiallisissa menetelmissä hyödynnetään sivuvirtausliuskoja . LFIA:lla on kuitenkin joitakin haittoja; esimerkiksi alhaisilla analyyttipitoisuuksilla tämä tekniikka voi aiheuttaa ongelmia herkkyyden suhteen .
Nanohiukkasten (NP), kuten kultaisten nanohiukkasten (AuNP), sisällyttäminen erilaisiin biotunnistuselementteihin (vasta-aineisiin, peptidiryhmittymiin, polymeereihin ja aptameereihin) tarjoaa tehokkaan strategian havaitsemisjärjestelmien suorituskyvyn parantamiseksi. AuNP-pohjainen paperi-biosensori aloitti hiljattain intensiiviset tutkimukset erilaisten tartuntatautien, kuten malarian, hepatiitti B -viruksen (HBV), dengueviruksen, ebolaviruksen (EBOV) ja muiden virusten diagnosoimiseksi. Tässä yhteydessä on osoitettu kolmenlaisia paperipohjaisia immunomäärityksiä, mukaan lukien kolorimetriset, fluoresenssipohjaiset ja sähkökemialliset immunomääritykset. Vaikka fluoresenssipohjaiset ja sähkökemialliset immunomääritykset ovat edistyneet herkkyyden suhteen, niihin liittyy myös monivaiheinen toiminta ja lukijasta riippuvuus havaitsemisen aikana, mikä vähentää loppukäyttäjien mukavuutta. Kolorimetriseen immunomääritykseen perustuvan immunomäärityksen etuihin kuuluvat alhaiset kustannukset, laitteettomuus, nopeus, luettavuus paljain silmin ja soveltuvuus korkean läpimenon seulontaan paikan päällä; tarkkuuden, herkkyyden ja kvantifioinnin parantaminen on kuitenkin edelleen haasteena.
Kädessä pidettävien havaitsemisalustojen osalta POC-menetelmää varten erityisesti tuberkuloosin havaitsemisessa kolorimetriseen menetelmään perustuvalla LFIA-menetelmällä näyttäisi olevan hyvä lähtökohta, koska tällä menetelmällä toteutettiin nopeita diagnooseja kenttätutkimusolosuhteissa, ja se on myös helppokäyttöinen. Lisäksi varhainen havaitseminen on ratkaisevan tärkeää, jotta tuberkuloosin vastainen hoito voidaan aloittaa ajoissa, mikä on avainasemassa kuolleisuuden vähentämisessä ja tuberkuloosiepidemian välttämisessä. Tämän saavuttamiseksi olemme keskittyneet M. tuberculosis -bakteerin erittäviin proteiineihin, jotka soveltuvat tuberkuloosin varhaiseen havaitsemiseen. Todettiin, että Rv3874- ja Rv3875-geenit koodaavat 10 kDa:n suuruista viljelyfiltraattiproteiinia (CFP10) ja 6 kDa:n suuruista varhaisen erittyvän antigeenin kohdeproteiinia (ESAT6). Nämä geenit sijaitsevat virulentin M. tuberculosis -bakteerin genomin ero-1-alueella (RD-1), ja ne ovat voimakkaita T-soluantigeenejä, jotka tunnistetaan yli 70 prosentissa tuberkuloosipotilaista. Jännittävä löytö oli, että ESAT6 ja sen proteiinikumppani CFP10 sitoutuvat tiiviisti toisiinsa suhteessa 1:1 hydrofobisten ja Van der Waalsin vuorovaikutusten kautta muodostaen ESAT6-CFP10-proteiinikompleksin. Molemmat proteiinit omaksuvat kompleksissa vakaan, täysin taitetun rakenteen, jossa noin kaksi kolmasosaa selkärangasta on säännöllisessä kierteisessä konformaatiossa. Meher ja työtoverit raportoivat, että ESAT6-CFP10-kompleksin muodostuminen johti rakenteellisiin muutoksiin, parempaan termodynamiikkaan ja biokemialliseen stabiilisuuteen sekä fosfolipidikalvoihin sitoutumisen heikkenemiseen . Tämä viittaa siihen, että ESAT6 ja CFP10 ovat aktiivisia kompleksina ja voivat antaa useita toiminnallisia etuja, kuten säätelyproteiinien, kuten transkriptiotekijöiden, aktiivisuuden tiukemman kontrollin ja yleisen mekanismin proteiini-proteiini- ja proteiini-nukleiinihappovuorovaikutusten spesifisyyden lisäämiseksi . Lisäksi Renshaw’n ja työtovereiden raportoima työ osoitti, että CFP10-ESAT6-antigeenin yhdistelmä lisäsi määrityksen diagnostista suorituskykyä verrattuna yksittäiseen antigeeniin .
Tässä työssä yhdistettiin LFIA:n ja CFP10-ESAT6:n ansiot tunnistusproteiinibiomarkkerina, ja kehitimme ensimmäistä kertaa kertakäyttöisen immunomääritykseen perustuvan testiliuskan uutena biosensorina tuberkuloosin nopeaan havaitsemiseen paljain silmin. Huomionarvoista on, että strategialla, joka sisälsi AuNP:t leimana, on ratkaiseva merkitys LFIA:n visuaalisen vaikutuksen ja vasteen voimakkuuden parantamisessa. Tämän äskettäin kehitetyn menetelmän suunnittelua ja vaste-periaatetta havainnollistetaan kuvassa 1. Vasta-aineet on sidottu LFIA:n eri kohtiin kohdeantigeenien vangitsemiseksi, ja vasta-aineisiin leimatut värilliset detektorireagenssit (AuNP:t) tuottavat värilliset vasteet LFIA:n testivyöhykkeelle ja kontrollivyöhykkeelle. Ominaisten värillisten kaistojen avulla kohdeanalyytti voidaan havaita visuaalisesti (paljain silmin). Tunnistussignaalin vahvistamiseksi ja anturin selektiivisyyden lisäämiseksi tuberkuloosispesifisten biomarkkereiden suhteen käytettiin sandwich-immunomääritysmuotoa. Molempien värillisten testiviivojen ja värillisten kontrolliviivojen näkyminen merkitsee positiivista tulosta (kuva 1(a)), kun taas yhden värillisen kontrolliviivan näkyminen merkitsee negatiivista tulosta (kuva 1(b)). Kontrolliviiva osoittaa, että näyte on siirtynyt kalvon läpi tarkoitetulla tavalla riippumatta siitä, onko näytteessä analyyttiä vai ei. Jos värillisiä viivoja ei näy lainkaan, tulosta pidetään virheellisenä, joten testi on toistettava.
(a)
(b)
(a)
(b)
Osoitimme myös kehitetyn LFIA:n tehokkuuden CFP10-ESAT6:n havaitsemisessa tuberkuloosiin sairastuneiden henkilöiden ihmisnäytteistä kerätystä ysköksestä. Tutkimus viittasi siihen, että verikokeeton menetelmä biomarkkereiden osoittamisen kautta ysköksestä saattaisi olla arvokas tuberkuloosin varhaisessa havaitsemisessa, erityisesti HIV-positiivisissa tapauksissa, ja näin ollen se voisi tarjota laajoja potentiaalisia sovelluksia kliiniseen analyysiin ja kotikäyttöön ilman perifeerisen laboratorion käyttöönottoa.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Tutkimusmenetelmät ja -menetelmät
. Materiaalit ja reagenssit
Polyklonaalinen anti-CFP10-vasta-aine, kanin M. tuberculosis-vasta-aine, kanin M. tuberculosis-vasta-aine HRP-konjugaatti, vuohen anti-kaniini-IgG-vasta-aine, M. tuberculosis ESAT-6:n kaltainen proteiini esxB (CFP-10) ja rekombinanttiset M. tuberculosis -immunogeenisen proteiinin MPT64-antigeenit ostettiin Cusabiolta (Selangor, Malesia). Naudan seerumin albumiini (BSA), ihmisen seerumi, kulta(III)kloriditrihydraatti, kaliumkarbonaatti, fosfaattipuskuroidun suolaliuoksen (PBS) tabletit ja Tween-20 ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). 3,30,5,50-tetrametyylibentsidiini (TMB) ELISA-substraatti ja natriumsitraatti saatiin Abcamilta (Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta) ja R&M Chemicalsilta (Essex, Yhdistynyt kuningaskunta). Malesian Kelantanissa sijaitsevan Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM) -sairaalan potilaiden ysköksenäytteitä käytettiin tunnistenumeroilla TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280 ja SA217. Ysköksenäytteen osalta suostumusta ei tarvittu, koska ysköksenäyte on vain HUSM:n laboratoriotarkoituksiin käytettyjä ylijäämänäytteitä. Lisäksi Malesian terveysministeriön lääketieteellisen tutkimuksen ja etiikan komitea (MREC) hyväksyi tässä tutkimuksessa käytetyn protokollan (hyväksyntänumero: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).
2.2. TUTKIMUKSEN TULOKSET Kulta-nanohiukkasten synteesi
Kulta-nanohiukkaset (AuNPs) syntetisoitiin sitraattipelkistysmenetelmällä, kuten aiemmin on raportoitu . Kultakloridiliuos valmistettiin liuottamalla kultakloridia 100 ml:aan deionisoitua vettä, ja valmistettu liuos säilytettiin valolta suojattuna. Sitten natriumsitraattiliuos valmistettiin juuri ennen käyttöä liuottamalla natriumsitraattia 100 ml:aan deionisoitua vettä ja suodatettiin. Kultakloridiliuosta kuumennettiin, kunnes liuos kiehui, ja natriumsitraattia lisättiin viisaasti pisara kerrallaan. 10 minuutin kuluttua pullo asetettiin vesihauteeseen jäähtymään vähintään 15 minuutiksi. Tämän jälkeen saadut AuNP:t kerättiin talteen ja säilytettiin jääkaapissa 4 °C:ssa myöhempään käyttöön asti. Syntetisoidut AuNP:t karakterisoitiin sitten UV-Vis- ja HRTEM-kuvauksen avulla.
2.3. Kanin M. tuberkuloosin vasta-aineen konjugointi AuNP:ien kanssa
Kanin M. tuberkuloosin vasta-aineen konjugointi AuNP:ien kanssa valmistettiin aiemmin kuvattujen menetelmien mukaisesti pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna 6 μl kanin M. tuberkuloosin vasta-ainetta (12 μg/ml) lisättiin 5 ml:aan kolloidisen kullan liuosta. Ennen käyttöä valmistetun AuNP-liuoksen pH-arvo säädettiin 8,0:aan käyttämällä 0,2 M kaliumkarbonaattia ja 0,1 M HCl:ää. Seosta sekoitettiin 10 minuutin ajan ja lisättiin 10 % naudan seerumin albumiinia. Seosta inkuboitiin 30 minuuttia ja säilytettiin yön yli 4 °C:ssa. Tämän jälkeen seosta sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 11 000 g:ssa konjugoimattomien vasta-aineiden poistamiseksi. Pelletti suspendoitiin uudelleen passiivisen laimennuspuskurin (PDB) kanssa, joka vastasi 1/10 alkuperäisestä tilavuudesta. Optinen tiheys (OD) tutkittiin UV-Vis-tekniikalla 540 nm:ssä, jotta saatiin . Lopuksi AuNP-liuoksen kanssa konjugoitu vasta-aine suodatettiin 0,45 μm:n selluloosa-asetaattisuodattimen läpi.
2.4. Testiviivan ja kontrolliviivan tiputtaminen nitroselluloosamembraanille
Kani IgG-vasta-aine annosteltiin nitroselluloosamembraanille kontrolliviivaksi pitoisuudella 1 mg/ml. Kani anti-M. tuberculosis -vasta-aine annosteltiin nitroselluloosamembraanille testilinjana pitoisuudella 1 mg/ml. Vasta-aine valmistettiin PBS-puskuriin ja 1 % sakkaroosiin. Nitroselluloosakalvo kuivattiin huoneenlämmössä ja säilytettiin 4 °C:ssa.
2.5. Lateral Flow Immunoassay Strips
LFIA-liuskat ostettiin Kestrel Bio Sciences (Thailand) Co., Ltd:ltä. LFIA:n rakenne on esitetty kuvassa 2. LFIA-liuskassa on kolme päällekkäistä tyynyä, jotka on sijoitettu taustakortille: näytetyyny (Millipore C048, ), kalvo (Whatman FF 60/100, ) ja pyyhkäisytyyny (Whatman 470, ). LFIA-liuskat koottiin taustakortille peräkkäin 1-2 mm:n päällekkäisyydellä. AuNP-liuoksella konjugoitu kanin M. tuberculosis -vasta-aine immobilisoitiin konjugaattityynylle (0,5 μl / 1 mm). Konjugaattityyny kuivattiin 37 °C:ssa 1 h. Tämän jälkeen vuohen anti-kani IgG-vasta-aine ja kanin anti-M. tuberkuloosivasta-aine vuorattiin nitroselluloosamembraanille kontrolli- ja testiriviksi. Kalvot kuivattiin huoneenlämmössä yön yli. Lopuksi LFIA-liuskat leikattiin 4 mm leveiksi liuskoiksi ja säilytettiin 4 °C:ssa käyttöön asti.
Ysköksenäytteet laimennettiin lyysipuskurilla, ja näytepehmusteelle annosteltiin 100 mikrometriä valmiiksi valmisteltua näytepohjaa. Valmistetut liuskat asetettiin vaakasuoraan 5-10 minuutiksi, jotta näyte pääsee virtaamaan näytetyynystä näytetyynyyn. Testiviivan ja kontrolliviivan kohdalla havaittiin punertava väri.
2.6. Perinteinen ELISA-testi (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, entsyymisidonnainen immunosorbenttianalyysi)
Näytteiden positiivisuuden ja negatiivisuuden vahvistamiseksi kehittelemäämme LFIA-testiin verrattuna tehtiin semikvantitatiivinen ELISA-testi. Tätä tarkoitusta varten ELISA 96-kuoppalevyt päällystettiin 100 μl:lla kanin M. tuberculosis -vasta-aineella, jonka pitoisuus oli 1 μg/ml karbonaattipuskurissa. ELISA-levy peitettiin parafilmillä ja inkuboitiin 2 tuntia. Tämän jälkeen jokainen päällystetty kuoppa pestiin kolme kertaa täyttämällä kuopat pesupuskurilla, joka sisälsi PBS:ää ja Tween-20:tä. Kaikki liuokset poistettiin pyyhkäisemällä levyä 2-3 kertaa sitoutumattoman proteiinin poistamiseksi. Pesuvaiheen jälkeen ELISA-levy estettiin lisäämällä 250 μl estopuskuria (PBS ja BSA) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. ELISA-levy pestiin uudelleen kolme kertaa pesupuskurilla ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 μl M. tuberculosis -bakteerin CFP10-ESAT6-antigeenin eri pitoisuuksia vasta-aineen laimennuspuskurissa, joka sisälsi PBS:ää, Tween-20:tä ja BSA:ta. Kaikki antigeenit testattiin kolmena kappaleena ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa. Antigeenin inkuboinnin jälkeen levy pestiin uudelleen kolme kertaa pesupuskurilla ja 100 μl kanin anti-M. tuberculosis HRP-konjugaattia lisättiin kuhunkin kuoppaan 1 tunnin ajaksi, minkä jälkeen pesuvaihe ja TMB-substraattiliuoksen lisääminen. Näytölle ilmestyy sininen väri, joka osoittaa leimatun havaitsemisvasta-aineen läsnäoloa komplementtivasta-aineen ja antigeenin välisen sitoutumisen yhteydessä. Lopuksi lisättiin 100 μl stop-liuosta (0,5 M H2SO4) ja absorbanssi luettiin ELISA-mikrolevylukijalla.
3. Tulokset ja keskustelu
3.1. Tulokset ja keskustelu
3.1. Tulokset ja keskustelu. Sandwich-muodon validointi käyttäen tavanomaista ELISA-menetelmää
Sandwich-strategian aistimismekanismin selventämiseksi ja käytettyjen vasta-aineiden erityisroolien arvioimiseksi tehtiin kontrollikokeita. ELISA-analyysia käytettiin vasta-aineen ja antigeenin sitoutumisen todentamiseksi testilinjalla, kuten kuvassa 3 esitetään.
(a)
(b)
(a)(b)
(b)
(b)
Detektointivasta-aine oli leimattu HRP-entsyymillä, joka saa aikaan värillisen signaalin, kun siihen lisättiin TMB:tä. Muodostettiin ELISA-sandwich-kompleksi, joka sisältää sieppausvasta-aineen, antigeenin ja detektiovasta-aineen (kuva 3(a)). Kuten kuvasta 3(a) nähdään, kontrollikuopassa ei näy värisignaalia, koska antigeenin puuttuminen ei aiheuta leimatun detektiovasta-aineen sitoutumista. ELISA-levyllä näkyy sininen signaali kuopissa, joissa on antigeenia, eikä sinistä signaalia ole havaittavissa antigeenin puuttuessa. Tulokset vahvistivat, että fuusioproteiini CFP10-ESAT6 on ollut loistava ehdokasantigeeni, jolla on korkea spesifisyys valituille vasta-aineille, joita käytettiin tässä työssä, joka perustuu ELISA:n immunodiagnostiikkaan sandwich-muodossa.
Vaikkakin ELISA osoittaa tehokkaan menetelmän M. tuberculosis -taudinaiheuttajan CFP10-ESAT6:n määrittämiseksi, työläs pesutapahtuma ja vasta-aineen vaadittu leimaaminen voivat rajoittaa tämän menetelmän laajaa käyttöä tuberkuloosin yksinkertaisessa ja nopeassa osoittamisessa. Niinpä tässä tutkimuksessa kehitimme yksinkertaisen, kannettavan, käyttäjäystävällisen ja nopean alustan CFP10-ESAT6-vasta-aineen määrittämiseksi tuberkuloosin diagnosoimiseksi LFIA:n avulla sandwich-määritysmuodossa, kuten kuvassa 3(b) on esitetty. AuNP:iden käyttö mahdollistaa punertavan värin havaitsemisen. Positiivinen tulos osoittaa havaitsemalla sekä värillisen testiviivan että värillisen kontrolliviivan, kun taas yhden värillisen kontrolliviivan havaitseminen osoittaa negatiivisen tuloksen. Nykyinen lateraalivirtauslaite on lupaava käytettäväksi sovelluksissa, joissa AuNP:t kiinnittyvät erityisten biologisten tunnistustapahtumien kautta (kohdesidontakonfiguraatio), kun kohdeanalyytti (CFP10-ESAT6) on läsnä. Kulta-nanopartikkelien kanssa konjugoitujen vasta-aineiden karakterisointi
Syntetisoidut AuNP:t karakterisoitiin käyttämällä UV-Vis- ja HRTEM-menetelmää maksimaalisen absorbanssin aallonpituuden () saamiseksi ja vastaavasti sitraattireduktiomenetelmällä syntetisoitujen AuNP:ien morfologian määrittämiseksi. Kuvan 4(a) perusteella AuNPs-hiukkanen absorboi valoa 520 nm:n absorbanssilla pintaplasmoniresonanssin vuoksi. Kuvassa 4(b) esitetty HRTEM-kuva edustaa selkeää kuvaa pallomaisista AuNP:istä, jotka ovat vähemmän aggregoituneita keskenään, ja saatujen AuNP:ien keskimääräinen koko on noin ~30 nm, kuten kuvassa 4(c) on esitetty.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
AuNP-merkintämenetelmää käytettiin M. tuberculosis -bakteerin nopeaan havaitsemiseen lateraalivirtausliuskoilla. AuNP:t, jotka oli konjugoitu kanin M. tuberkuloosin vasta-aineella, optimoitiin siten, että saatiin vakaa rubiininpunainen väri, joka näkyi signaalina testiviivassa ja kontrolliviivassa. Kultakolloidin stabiilisuutta tutkittiin kolloidin absorptiosta eri vasta-ainepitoisuuksien lisäämisen jälkeen. Optimaalinen stabiloiva vasta-ainepitoisuus määritettiin käyttämällä eri vasta-ainepitoisuuksia. Konjugointia varten vasta-aineet kiinnittyvät AuNP:n pintaan fysikaalisten ja kemiallisten vuorovaikutusten avulla. Vasta-aine adsorboituu epäspesifisesti AuNP:iin, kun taas negatiivisesti varautuneet nanohiukkaset varmistivat stabiliteetin kolloidiliuoksessa . Kultakolloidin stabiilisuutta tutkittiin kolloidin absorptiosta sen jälkeen, kun siihen oli lisätty eri konsentraatioita vasta-ainetta.
Kuvassa 5(a) on esitetty vasta-ainetta sisältävän AuNP-liuoksen värimuutokset eri konsentraatioilla. Liuoksen väri muuttui punaisesta siniseksi sen jälkeen, kun siihen lisättiin NaCl:n läsnäollessa matala pitoisuus kanin M. tuberkuloosia vastustavaa vasta-ainetta. AuNP:iden punainen väri pysyy vakaana, kun vasta-ainetta lisättiin korkea pitoisuus tai ylimääräinen määrä. Kolloidisen kullan stabiloimiseksi tarvittava vasta-aineen vähimmäispitoisuus oli noin 10 μg/ml, kuten kuvassa 5 b on esitetty. Kun vasta-ainetta oli 10 μg 1 ml kultaliuosta kohti, vasta-aine sitoutui riittävästi AuNP:iin. Enemmän proteiinia sitoutui AuNP:iin vasta-aineen pitoisuuden kasvaessa, jolloin kaikki käytettävissä olevat sitoutumispaikat olivat varattuja. Kuvassa 5(c) esitetään AuNP-liuokseen konjugoidun vasta-aineen eri pitoisuuksien UV-Vis-absorptiospektrit. SPR-absorption maksimi liuoksissa 1-8 (korkeiden vasta-ainepitoisuuksien liuokset) näkyy suunnilleen 550 nm:ssä, kun taas liuoksissa 9-11 (matalampien vasta-ainepitoisuuksien liuokset) näkyy pitkä aallonpituuden siirtymä 570 nm:ssä. Tämä johtuu AuNP:iden aggregaatiosta, joka näkyy liuoksissa 9-11.
(a)
(b)
(c)
(c)
(c)
(c)
(c)
(c)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
3.3. Sivuvirtausimmunomäärityksen karakterisointi antigeenin ja vasta-aineen tuberkuloosin osoittamiseksi
Testiliuskat rakennettiin kuvassa 6 esitetyllä tavalla. Liuskassa on kolme pääelementtiä: konjugaattityyny, kalvo ja absorboiva tyyny. Whatman-kalvoa käytettiin, jotta näytteen virtaus olisi sujuvaa. Näyte näytetyynystä virtaa konjugaattityynyn läpi aina wicking-tyynyyn asti. Pyyhkäisytyyny veti näytteen testi- ja kontrollilinjojen yli pidättämällä ylimääräisen näytteen. AuNP:iden kanssa konjugoitu vasta-aine talletettiin konjugaattityynylle. Kanin M. tuberculosis -vasta-aine kohdistettiin kalvolle, jonka tiedettiin olevan testiviiva. Toinen viiva kohdistettiin vuohen anti-kani IgG-vasta-aineella, ja sitä kutsuttiin kontrolliviivaksi. Testilinjalla oleva vasta-aine vangitsee antigeenin, joka oli sitoutunut AuNP:llä leimattuun vasta-aineeseen. Tämän seurauksena testilinjalla voitiin havaita punertava signaaliväri. Kontrollilinjalla oleva kanin IgG-vasta-aine vangitsee jäljelle jäävän AuNP-merkityn vasta-aineen, ja validointitestinä se voi aina näyttää signaalia.
(a)
(b)
(b)
(a)
Nitroselluloosamembraanilla oleva kontrolliviiva optimoitiin siten, että selvä punertava signaali voitiin havaita paljain silmin. Testiliuskat testattiin lyysipuskurilla (ei antigeeniä), ja puskurin annettiin virrata sivusuunnassa nitroselluloosakalvolla. Kontrolliliuskan punertava signaali voidaan havaita paljain silmin kuvassa 6(a) esitetyllä tavalla 5-10 minuutin puskurilatauksen jälkeen. Kun lateraalivirtausliuskoja testattiin positiivista tuberkuloosia sairastavien potilaiden kliinisellä näytteellä, näytetyynylle annosteltiin 100 μl liuosta. Kuten kuvassa 6(b) näkyy, testiviivalla ja kontrolliviivalla voitiin havaita punertava signaali. Tämä tulos osoittaa, että testiviivalla oleva vasta-aine sitoutui onnistuneesti ysköksenäytteessä olevaan CFP10-ESAT6-antigeeniin.
Kehitettyä LFIA:ta testattiin edelleen erityyppisillä antigeeneillä liuskojen spesifisyyden todentamiseksi. Kunkin liuskan testiviivaa, joka on poistettu vasta-aineella, tarkkailtiin 5-10 minuutin kuluttua sen jälkeen, kun kukin kohde oli virrannut näytetyynyltä pyyhkäisytyynylle. Kuten kuvasta 7 käy ilmi, signaali näkyi liuskan testiviivalla, kun ysköksenäyte ladattiin 10 minuutin kuluttua. Samaan aikaan kontrolliliuskan testiviivalla ei havaittu signaalia, mikä osoittaa, että näytteessä ei ollut mitään kohdetta. Tulokset osoittavat vasta-aineen spesifisen kohteen testirivillä, kun signaalia ei näkynyt testirivillä, kun liuskoilla testattiin rekombinantti M. tuberculosis -immunogeenista proteiinia MPT64-antigeenia ja ihmisen seerumin albumiinia. Näin ollen kehitetty LFIA havaitsee spesifisesti CFP10-ESAT6:ta sisältävän ysköksenäytteen ja testiviivalla oleva vasta-aine vangitsee vain näytteen spesifisen kohteen.
3.4. Uusittavuustutkimus
Kehitettyjen LFIA-liuskojen uusittavuustutkimusta sovellettiin valmistamalla kolme liuskaa samasta erästä kutakin kliinistä ysköksenäytepotilasta varten. Kuvan 8 perusteella kukin eri tuberkuloosipositiivisten potilaiden (1-5) ja tuberkuloosinegatiivisten potilaiden (6) ysköksenäyte testattiin LFIA-liuskoilla, ja tulokset havainnoitiin sen jälkeen, kun ysköksenäytteet oli ladattu näytetyynylle. Kunkin liuskan tulokset osoittavat, että sekä testiviivalla että kontrolliviivalla on signaali 5-10 minuutin kuluttua. Näin ollen M. tuberculosis -bakteerin CFP10-ESAT6-antigeeni tuberkuloosipotilaiden kliinisestä ysköksenäytteestä havaittiin vasta-aineella liuskojen jokaisella testirivillä. Nämä tulokset viittasivat siihen, että kunkin liuskan tarkkuus arvioitiin valitsemalla LFIA satunnaisesti analyyttinäytteen havaitsemista varten. Sen varmistamiseksi, että värimuutos johtuu komplementaarisen kohdevasta-aineen kiinnittymisestä kehitetyssä LFIA-liuskassa olevaan sieppausvasta-aineeseen, käytettiin lisätestiä käyttämällä tuberkuloosinegatiivisen potilaan (potilas 6) ysköksenäytettä. Kun näyte oli ladattu liuskan näytetyynylle 5-10 minuutin ajaksi, testi ei osoittanut merkittävää värimuutosta testiviivalla verrattuna kontrolliviivaan, mikä viittaa siihen, että kohdeantigeeni ei ole sitoutunut epäspesifisesti kaappausvasta-aineeseen testiviivan vyöhykkeellä. Tämä osoittaa, että värin havaitseminen tapahtui M. tuberculosis -bakteerin komplementaarisen kohdeantigeenin ja kehitetyn LFIA-liuskan funktionalisoidun vasta-aineen kiinnittymisen kautta.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Johtopäätökset
Osoitimme nopean, yksinkertaisen ja kohtuuhintaisen LFIA:han perustuvan menetelmän tuberkuloosin ultrasensitiivistä paljain silmin tapahtuvaa havaitsemisjärjestelmää varten. CFP10-ESAT6:n havaitseminen tässä äskettäin kehitetyssä immunosensorissa esitetyllä sandwich-muotoisella menettelyllä osoittaa yksinkertaisen ja helpon alustan, joka voi tarjota nopean vaihtoehtoisen strategian, jota voidaan käyttää tuberkuloosin diagnosoinnissa ELISA-menetelmään verrattuna. Kehitetty sandwich-immunomääritys osoitti poikkeuksellisen hyvän havaitsemisvasteen CFP10-ESAT6:lle ysköksenäytteessä kliinistä näytesovellusta varten ja osoitti korkean herkkyyden, spesifisyyden ja toistettavuuden kertakäyttöisenä anturina. Tämä liuska-pohjainen immunomääritys voisi tarjota suuren potentiaalin edullisessa ja POC-sovelluksessa tuberkuloosin diagnosointiin.
Tietojen saatavuus
Tämän tutkimuksen tulosten tukena käytetyt tiedot sisältyvät artikkeliin.
Esintressiristiriidat
Tekijät ilmoittavat, että tämän artikkelin julkaisemiseen ei liity eturistiriitoja.
Kiitokset
Tekijät haluavat kiittää Malesian korkeakouluministeriötä ja Universiti Putra Malesiaa Malesian tutkimusyliopistoverkoston (Malaysia Research University Network, MRUN)-Universiti Putra Malesian (UPM) kautta saadusta taloudellisesta tuesta (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230). Erityiskiitokset kuuluvat myös Siti Suraiyalle HUSM Kubang Kerianista, Kelantanista, joka auttoi todellisten näytteiden testaamisessa.
Vastaa