Inmunoensayo de flujo lateral para la detección a ojo desnudo de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis. La detección y el control de las enfermedades infecciosas es un problema importante, especialmente en los países en desarrollo. El inmunoensayo de flujo lateral (LFIA) se ha introducido como una plataforma portátil basada en el inmunoensayo en el punto de atención para una detección automatizada de la tuberculosis. El antígeno CFP10-ESAT6 de M. tuberculosis se utilizó como objetivo en la detección precoz de la tuberculosis mediante la estrategia POC basada en tiras de LFIA. Una interesante plataforma basada en señales ópticas se implementa como un cambio de color en el área de detección que es visible a simple vista. Las nanopartículas de oro (AuNPs) se utilizaron como la sonda de color para la detección de un objetivo de interés. La imagen de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) y el análisis del espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-Vis) confirmaron que las AuNPs sintetizadas eran adecuadas para el inmunoensayo diseñado. La plataforma consiste en AuNPs conjugadas con anticuerpos (Ab) específicos para capturar el antígeno de M. tuberculosis. Bajo el efecto capilar, se realizaron inmunorreacciones en sándwich de AuNP-Ab-antígeno en la almohadilla de prueba de la tira inmunológica, que pueden ser observadas por la señal de color en la línea de prueba de la tira con un corto tiempo de ensayo. Además, el biosensor recién desarrollado se utilizó en la detección del antígeno CFP10-ESAT6 en muestras de esputo humano con resultados satisfactorios. Las bandas coloreadas características permiten la detección visual (a simple vista) del analito objetivo sin instrumentación. Este sistema de diagnóstico no invasivo que se basa en la detección de esputo podría proporcionar pruebas de diagnóstico fáciles de usar y asequibles en los países en desarrollo.

1. Introducción

La tuberculosis (TB) es una de las enfermedades infecciosas más mortíferas que se ha convertido en un importante problema de salud pública en todo el mundo. La enfermedad es causada principalmente por la infección de Mycobacterium tuberculosis, que puede ser transmitida a través de pequeñas gotas de aerosol como la tos, estornudos, o incluso hablar por una persona infectada TB . Esta enfermedad contagiosa que se transmite por el aire provoca más de nueve millones de nuevos casos al año, lo que convierte a la tuberculosis en la segunda causa de muerte después de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) . Las principales razones de la elevada tasa de prevalencia de la tuberculosis son el acceso inadecuado a métodos de diagnóstico eficaces y la incapacidad de tratar todos los casos infecciosos de tuberculosis pulmonar en el momento oportuno, lo que permite que continúe la transmisión de M. tuberculosis dentro de las comunidades.

La norma de oro actual para el diagnóstico de la tuberculosis es la microscopía de frotis de esputo, la radiología de tórax y el cultivo sólido . Aunque los métodos son capaces de diagnosticar la tuberculosis, estas pruebas están limitadas por su escasa sensibilidad, baja especificidad y un proceso que requiere mucho tiempo. Se han desarrollado sistemas basados en la amplificación de ácidos nucleicos que ofrecen mejoras relativas en cuanto a sensibilidad, especificidad y detección rápida de M. tuberculosis con respecto a las técnicas convencionales. Sin embargo, este método requiere un alto nivel de competencia técnica y un equipo de alto coste y sólo se utiliza en laboratorios competentes que puedan permitirse reactivos de referencia para controlar el rendimiento del ensayo . Dado que la tuberculosis es una enfermedad de la pobreza, en la que más del 90% de la carga mundial de tuberculosis tiene lugar en países de ingresos bajos y medios, existe una necesidad insatisfecha de métodos de diagnóstico fiables para identificar la enfermedad de la tuberculosis de forma rápida, eficiente y precisa de una manera económica para ser utilizada en entornos con recursos limitados.

Los inmunoensayos basados en papel representan una técnica poderosa con gran relevancia en la biosensación, ya que logró los requisitos necesarios para los dispositivos de punto de atención (POC), incluyendo la detección rápida, una pequeña cantidad de muestra y un bajo costo para que más personas puedan recibir convenientemente una atención médica rentable en áreas de recursos limitados . Los inmunoensayos POC basados en papel se componen generalmente de tres componentes principales, a saber, el papel como sustrato, los anticuerpos como elemento de detección y las moléculas informadoras como elemento transformador de la señal. El inmunoensayo de flujo lateral (LFIA), también conocido como biosensores basados en tiras, es una de las plataformas existentes basadas en papel que representan la estrategia más favorable para el análisis in situ y de un solo sensor (desechable) . Cabe mencionar que los enfoques electroquímicos también están aprovechando las tiras de flujo lateral . Sin embargo, LFIA tiene algunos inconvenientes; por ejemplo, a bajas concentraciones de analito, esta tecnología puede presentar problemas en términos de sensibilidad .

La incorporación de nanopartículas (NPs), como las nanopartículas de oro (AuNPs) con diferentes elementos de biorreconocimiento (anticuerpos, conjuntos de péptidos, polímeros y aptámeros), proporciona una estrategia eficaz para mejorar el rendimiento de los sistemas de detección. El biosensor de papel basado en AuNP inició estudios intensivos recientemente para el diagnóstico de diversas enfermedades infecciosas, como la malaria , el virus de la hepatitis B (VHB) , el dengue , el virus del Ébola (EBOV) y otros virus . En este contexto, se han demostrado tres tipos de inmunoensayos basados en papel, que incluyen inmunoensayos basados en la colorimetría, en la fluorescencia y en la electroquímica. Aunque los inmunoensayos basados en la fluorescencia y los basados en la electroquímica muestran méritos avanzados en términos de sensibilidad, también implican los problemas de la operación de varios pasos y la dependencia del lector durante la detección, lo que reduce la comodidad de los usuarios finales. Mientras tanto, las ventajas del inmunoensayo colorimétrico incluyen su bajo coste, la ausencia de equipos, la rapidez, la lectura a simple vista y la idoneidad para el cribado de alto rendimiento in situ; sin embargo, las mejoras en la precisión, la sensibilidad y la cuantificación siguen siendo sus retos.

En lo que respecta a las plataformas de detección portátiles para el POC, en particular para la detección de la tuberculosis, el LFIA colorimétrico parece ser un buen comienzo, ya que este método realiza diagnósticos rápidos en condiciones de campo, así como un funcionamiento sencillo. Además, la detección temprana es fundamental para permitir el inicio oportuno del tratamiento antituberculoso, que es la clave para reducir la mortalidad y evitar la epidemia de TB. Para conseguirlo, nos hemos centrado en las proteínas secretoras de M. tuberculosis adecuadas para la detección temprana de la tuberculosis. Se descubrió que la proteína de filtrado de cultivo de 10 kDa (CFP10) y el antígeno secretado temprano de 6 kDa (ESAT6) están codificados por los genes Rv3874 y Rv3875, respectivamente. Estos genes están localizados en la región de diferencia-1 (RD-1) del genoma virulento de M. tuberculosis, que son potentes antígenos de células T reconocidos en más del 70% de los pacientes con tuberculosis. Un descubrimiento emocionante fue que la ESAT6 y su compañera proteica, la CFP10, se unen estrechamente entre sí en una proporción de 1 : 1 mediante interacciones hidrofóbicas y de Van der Waals para formar un complejo proteico ESAT6-CFP10. Ambas proteínas adoptan una estructura estable y completamente plegada en el complejo, con aproximadamente dos tercios de la columna vertebral en una conformación helicoidal regular. Meher y sus colaboradores informaron de que la formación del complejo ESAT6-CFP10 dio lugar a cambios estructurales, una mayor termodinámica y estabilidad bioquímica, y la pérdida de la unión a las membranas de fosfolípidos . Esto sugiere que ESAT6 y CFP10 son activos como un complejo y pueden conferir varias ventajas funcionales, incluyendo un control más estricto de la actividad de las proteínas reguladoras, como los factores de transcripción, y un mecanismo general para aumentar la especificidad de las interacciones proteína-proteína y proteína-ácido nucleico . Además, el trabajo realizado por Renshaw y colaboradores demostró que la combinación del antígeno CFP10-ESAT6 aumentaba el rendimiento diagnóstico del ensayo en comparación con un solo antígeno.

En este trabajo, se combinaron los méritos de LFIA y CFP10-ESAT6 como biomarcador proteico de identificación, y por primera vez, desarrollamos una tira reactiva desechable basada en el inmunoensayo como un novedoso biosensor para la detección rápida de la tuberculosis a simple vista. Cabe destacar que la estrategia que incorporó AuNPs como etiqueta desempeña un papel crucial en la mejora del efecto visual y las intensidades de respuesta de LFIA. El diseño y el principio de respuesta de este método recién desarrollado se ilustran en la Figura 1. Los anticuerpos se unen en diferentes posiciones del LFIA para capturar los antígenos objetivo, y los reactivos detectores coloreados etiquetados (AuNPs) en los anticuerpos dan las respuestas coloreadas en la zona de prueba y la zona de control en el LFIA. Las bandas coloreadas características permiten la detección visual (a simple vista) del analito objetivo. Se utilizó un formato de inmunoensayo en sándwich para amplificar la señal de detección, así como para aumentar la selectividad del sensor hacia los biomarcadores específicos de la tuberculosis. La aparición de una línea de prueba y una línea de control coloreadas indica un resultado positivo (Figura 1(a)), mientras que la observación de una sola línea de control coloreada indica un resultado negativo (Figura 1(b)). La línea de control indica que la muestra ha migrado a través de la membrana según lo previsto, independientemente de que el analito esté presente o no en la muestra. Si no aparece ninguna línea de color, se considera un resultado no válido; por lo tanto, hay que repetir la prueba.

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Figura 1

Ilustración esquemática del principio de detección basado en el biosensor de tira reactiva de flujo lateral con oro coloidal como etiqueta. (a) Resultado positivo que indica la presencia de M. tuberculosis detectada por la observación de dos líneas de color (paciente infectado por tuberculosis). (b) Resultado negativo que indica que no hay presencia de M. tuberculosis en la muestra (persona sana). Sólo apareció una línea de color.

También demostramos la eficacia del LFIA desarrollado para la detección de CFP10-ESAT6 en esputo, recogido de muestras humanas de personas infectadas por la TB. El estudio sugirió que el método libre de análisis de sangre a través de la detección de biomarcadores en esputo podría ser de valor en la detección temprana de la enfermedad de la tuberculosis, especialmente en los casos VIH-positivos, y por lo tanto podría proporcionar amplias aplicaciones potenciales en el análisis clínico y el uso en el hogar sin la implementación de laboratorio periférico.

2. Materiales y Métodos

2.1. Materiales y reactivos

El anticuerpo policlonal anti-CFP10, el conjugado HRP de conejo anti-M. tuberculosis, el anticuerpo IgG de cabra anti-conejo, la proteína esxB similar a la ESAT-6 de M. tuberculosis (CFP-10) y los antígenos de la proteína inmunogénica MPT64 recombinante de M. tuberculosis se adquirieron de Cusabio (Selangor, Malasia). La albúmina de suero bovino (BSA), el suero humano, el cloruro de oro (III) trihidratado, el carbonato de potasio, las tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el Tween-20 se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El sustrato ELISA de 3,30,5,50-Tetrametilbencidina (TMB) y el citrato de sodio se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido) y R&M Chemicals (Essex, Reino Unido), respectivamente. Se utilizaron muestras de esputo de pacientes del Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM), Kelantan, Malasia, con los números de identificación TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280 y SA217. En el caso de la muestra de esputo, se renunció a la necesidad de consentimiento porque la muestra de esputo es sólo muestras sobrantes que se han utilizado para fines de laboratorio del HUSM. Además, el protocolo utilizado en este estudio fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación Médica (MREC) del Ministerio de Salud de Malasia (Número de aprobación: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).

2.2. Síntesis de nanopartículas de oro

Las nanopartículas de oro (AuNPs) se sintetizaron por el método de reducción de citrato como se informó previamente . Se preparó una solución de cloruro de oro disolviendo cloruro de oro en 100 ml de agua desionizada, y la solución preparada se almacenó protegida de la luz. A continuación, se preparó una solución de citrato de sodio antes de su uso disolviendo un citrato de sodio en 100 ml de agua desionizada y se filtró. La solución de cloruro de oro se calentó hasta que la solución hirvió, y el citrato de sodio se añadió sabiamente gota a gota. Después de 10 minutos, el matraz se colocó en un baño de agua para que se enfriara durante al menos 15 minutos. A continuación, se recogieron las AuNPs resultantes y se almacenaron en un frigorífico a 4°C hasta su posterior utilización. Las AuNPs sintetizadas se caracterizaron mediante UV-Vis e imagen HRTEM.

2.3. Conjugación del anticuerpo anti-M. tuberculosis de conejo con AuNPs

La conjugación del anticuerpo anti-M. tuberculosis de conejo con AuNPs se preparó según los métodos descritos anteriormente con una ligera modificación. Brevemente, se añadieron 6 μl de anticuerpo anti-M. tuberculosis de conejo (12 μg/ml) a 5 ml de solución de oro coloidal. Antes de su uso, el valor del pH de la solución de AuNP preparada se ajustó a 8,0 utilizando carbonato potásico 0,2 M y HCl 0,1 M. La mezcla se agitó durante 10 minutos y se añadió un 10% de albúmina de suero bovino. La mezcla se incubó durante 30 minutos y se almacenó durante la noche a 4°C. Después, la mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 11.000 g para eliminar los anticuerpos no conjugados. El pellet se resuspendió con tampón diluyente pasivo (PDB) equivalente a 1/10 del volumen original. La lectura de la densidad óptica (DO) se estudió mediante UV-Vis a 540 nm para obtener . Finalmente, la solución de anticuerpo conjugado con AuNP se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 μm.

2.4. Manchado de la línea de prueba y de la línea de control en la membrana de nitrocelulosa

El anticuerpo IgG de conejo se dispensó en la membrana de nitrocelulosa como línea de control a una concentración de 1 mg/ml. El anticuerpo de conejo anti-M. tuberculosis a una concentración de 1 mg/ml se dispensó en una membrana de nitrocelulosa como línea de prueba. El anticuerpo se preparó en tampón PBS y sacarosa al 1%. La membrana de nitrocelulosa se secó a temperatura ambiente y se almacenó a 4°C.

2.5. Tiras de inmunoensayo de flujo lateral

Las tiras de LFIA se compraron a Kestrel Bio Sciences (Tailandia) Co. La construcción de LFIA se demuestra en la Figura 2. La tira LFIA está diseñada con tres almohadillas superpuestas colocadas en una tarjeta de soporte: almohadilla de muestra (Millipore C048, ), membrana (Whatman FF 60/100, ) y almohadilla de mecha (Whatman 470, ). Las tiras de LFIA se montaron en la tarjeta de soporte secuencialmente con un solapamiento de 1-2 mm. El anticuerpo de conejo anti-M. tuberculosis conjugado con la solución de AuNP se inmovilizó en una almohadilla de conjugado (0,5 μl por 1 mm). La almohadilla de conjugado se secó a 37 °C durante 1 h. A continuación, se alinearon en la membrana de nitrocelulosa el anticuerpo IgG de cabra anti-conejo y el anticuerpo de conejo anti-M. tuberculosis para formar la línea de control y la línea de prueba, respectivamente. Las membranas se secaron a temperatura ambiente durante la noche. Finalmente, las tiras de LFIA se cortaron en tiras de 4 mm de ancho y se almacenaron a 4°C hasta su uso.

Figura 2

Diseño del inmunoensayo de flujo lateral (LFIA).

Las muestras de esputo se diluyeron con tampón de lisis, y se aplicaron 100 μl de la muestra preparada en la almohadilla de muestra. Las tiras preparadas se colocaron en posición horizontal durante 5-10 minutos para permitir que la muestra fluyera de la almohadilla de muestra a la almohadilla de mecha. Se observó la aparición de un color rojizo en la línea de prueba y en la línea de control.

2.6. Prueba convencional de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA)

Para confirmar la positividad y negatividad de las muestras en comparación con nuestro LFIA desarrollado, se realizó una prueba ELISA semicuantitativa. Para ello, se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos con 100 μl de anticuerpo de conejo anti-M. tuberculosis con una concentración de 1 μg/ml en tampón de carbonato. La placa ELISA se cubrió con parafilm y se incubó durante 2 h. A continuación, cada pocillo recubierto se lavó 3 veces llenando los pocillos con tampón de lavado que contenía PBS y Tween-20. Todas las soluciones se eliminaron agitando la placa 2-3 veces para eliminar cualquier proteína no unida. Tras el paso de lavado, la placa ELISA se bloqueó añadiendo 250 μl de tampón de bloqueo (PBS y BSA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa ELISA se lavó de nuevo 3 veces con tampón de lavado y se añadieron a cada pocillo 100 μl de diferentes concentraciones de antígeno CFP10-ESAT6 de M. tuberculosis en tampón diluyente de anticuerpos que contenía PBS, Tween-20 y BSA. Todos los antígenos se probaron por triplicado y se incubaron durante la noche a 4°C. Tras la incubación del antígeno, la placa se lavó de nuevo 3 veces utilizando tampón de lavado y se añadieron 100 μl de conjugado HRP anti-M. tuberculosis de conejo en cada pocillo durante 1 h, seguido del paso de lavado y la adición de solución de sustrato TMB. Aparecerá un color azul que indica la presencia del anticuerpo de detección marcado con el complemento de unión anticuerpo-antígeno. Por último, se añadieron 100 μl de solución de parada (0,5 M H2SO4) y se obtuvo la lectura de la absorbancia utilizando un lector de microplacas ELISA.

3. Resultados y discusión

3.1. Validación del formato sándwich mediante el procedimiento ELISA convencional

Para explicar mejor el mecanismo de detección de la estrategia sándwich y evaluar las funciones específicas de los anticuerpos empleados, se realizaron experimentos de control. Se empleó el análisis ELISA para verificar la unión del anticuerpo y el antígeno en la línea de prueba, como se muestra en la Figura 3.

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El anticuerpo de detección se marcó con la enzima HRP que inducirá una señal de color cuando se añada TMB. Se formó el complejo ELISA tipo sándwich, que incluye el anticuerpo de captura, el antígeno y el anticuerpo de detección (Figura 3(a)). Como puede verse en la Figura 3(a), el pozo de control no muestra ninguna señal de color, ya que la ausencia de antígeno no provocará la unión del anticuerpo de detección marcado. La placa ELISA muestra la señal azul en los pocillos con antígeno y no se observa ninguna señal azul en ausencia de antígeno. Los resultados confirmaron que la proteína de fusión CFP10-ESAT6 ha sido un gran antígeno candidato con alta especificidad para los anticuerpos seleccionados utilizados en este trabajo basado en el formato de sándwich de inmunodiagnóstico en ELISA.

Aunque ELISA muestra un método eficaz para la determinación de CFP10-ESAT6 en M. tuberculosis, los tediosos procedimientos de lavado y el etiquetado de anticuerpos requerido pueden limitar el amplio uso de este método para la detección simple y rápida de la tuberculosis. Por lo tanto, en el presente estudio, establecimos una plataforma simple, portátil, fácil de usar y rápida para la determinación del anticuerpo anti-CFP10-ESAT6 para el diagnóstico de la TB basado en LFIA en formato de ensayo de sándwich, como se muestra en la Figura 3(b). El uso de AuNPs permite la observación del color rojizo. Un resultado positivo indica por observación tanto una línea de prueba coloreada como una línea de control coloreada, mientras que la observación de una sola línea de control coloreada indica un resultado negativo. El actual dispositivo de flujo lateral se muestra prometedor para su uso en aplicaciones en las que las AuNPs se adhieren mediante eventos de reconocimiento biológico específicos (configuración de unión a la diana) cuando el analito diana (CFP10-ESAT6) está presente.

3.2. Caracterización del anticuerpo conjugado con nanopartículas de oro

Las AuNPs sintetizadas se caracterizaron mediante el uso de UV-Vis y HRTEM para obtener la longitud de onda de la absorbancia máxima () y para determinar la morfología de las AuNPs que han sido sintetizadas por el método de reducción de citrato, respectivamente. Según la Figura 4(a), la partícula de AuNPs absorbe la luz a una absorbencia de 520 nm debido a la resonancia de plasmón superficial. La imagen HRTEM mostrada en la Figura 4(b) representa una imagen clara de AuNPs esféricas menos agregadas entre sí, y el tamaño medio de las AuNPs obtenidas es de aproximadamente ~30 nm como se muestra en la Figura 4(c).

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El enfoque de etiquetado de AuNP se utilizó como detección rápida de M. tuberculosis utilizando tiras de flujo lateral. Las AuNP que se conjugaron con el anticuerpo anti-M. tuberculosis de conejo se optimizaron para obtener un color rojo rubí estable para su aparición como señal en la línea de prueba y en la línea de control. La estabilidad del coloide de oro se examinó a partir de la absorción del coloide tras la adición de diferentes concentraciones de anticuerpo. La concentración óptima de anticuerpo estabilizador se determinó utilizando diferentes concentraciones de anticuerpo. Para la conjugación, los anticuerpos se unen a la superficie de la AuNP mediante interacciones físicas y químicas . El anticuerpo se adsorbe inespecíficamente en las AuNP mientras que la estabilidad en la solución coloidal fue proporcionada por las nanopartículas cargadas negativamente . La estabilidad del coloide de oro se examinó a partir de la absorción del coloide tras la adición de diferentes concentraciones de anticuerpo.

La figura 5(a) muestra los cambios de color de la solución de AuNP que contiene anticuerpo con diferentes concentraciones. El color de la solución cambió de rojo a azul tras la adición de una baja concentración de anticuerpo anti-M. tuberculosis de conejo en presencia de NaCl. El color rojo de las AuNPs permanece en un estado estable cuando se añade una alta concentración o una cantidad excesiva de anticuerpo. La concentración mínima de anticuerpo para estabilizar el oro coloidal fue de aproximadamente 10 μg/ml, como se muestra en la Figura 5(b). Con 10 μg de anticuerpo por 1 ml de solución de oro, el anticuerpo se unió adecuadamente a las AuNPs. A medida que aumentaba la concentración de anticuerpo, se unía más proteína a las AuNPs, en las que se ocupaban todos los sitios de unión disponibles. La figura 5(c) muestra los espectros de absorbancia UV-Vis de diferentes concentraciones de anticuerpo conjugado con la solución de AuNP. El máximo de absorción SPR para las soluciones 1 a 8 (de anticuerpos de alta concentración) se muestra aproximadamente a 550 nm, mientras que las soluciones 9 a 11 (anticuerpos de menor concentración) muestran una longitud de onda larga desplazada a 570 nm. Esto se debe a la agregación de AuNPs que se muestra en las soluciones 9 a 11.

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3.3. Caracterización del inmunoensayo de flujo lateral para la detección de la tuberculosis por antígeno-anticuerpo

Se construyeron tiras de prueba como se muestra en la Figura 6. Hay tres elementos principales en una tira: una almohadilla de conjugado, una membrana y una almohadilla absorbente. Se utilizó una membrana Whatman para que el flujo de la muestra fluyera sin problemas. La muestra de la almohadilla de muestra fluye a través de la almohadilla conjugada hasta la almohadilla de mecha. La almohadilla de mecha arrastró la muestra sobre las líneas de prueba y de control atrapando el exceso de muestra. El anticuerpo conjugado con AuNPs se depositó en la almohadilla de conjugado. El anticuerpo de conejo anti-M. tuberculosis se alineó en la membrana que se sabía que era la línea de prueba. La otra línea se alineó con el anticuerpo IgG de cabra anti-conejo y se conoce como la línea de control. El anticuerpo de la línea de prueba capturará el antígeno que se unió al anticuerpo marcado con AuNPs. Como resultado, se pudo observar una señal de color rojizo en la línea de prueba. El anticuerpo IgG de conejo en la línea de control capturará el anticuerpo marcado con AuNP restante y siempre podría mostrar señal como prueba de validación.

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La línea de control en la membrana de nitrocelulosa fue optimizada para que una señal rojiza clara pudiera ser observada a simple vista. Las tiras de prueba se probaron con tampón de lisis (sin antígeno), y se dejó que el tampón fluyera lateralmente en la membrana de nitrocelulosa. La señal rojiza en la línea de control puede observarse a simple vista, como se muestra en la Figura 6(a), tras 5-10 minutos de carga de tampón. Al probar las tiras de flujo lateral con una muestra clínica de pacientes con tuberculosis positiva, se dispensaron 100 μl de solución en la almohadilla de la muestra. Como se muestra en la Figura 6(b), se pudo observar una señal rojiza en la línea de prueba y en la línea de control. Este resultado indica que el anticuerpo de la línea de prueba se unió con éxito al antígeno CFP10-ESAT6 en la muestra de esputo.

El LFIA desarrollado se probó además con diferentes tipos de antígeno para verificar la especificidad de las tiras. La línea de prueba de cada tira que ha sido manchada con el anticuerpo se observó después de 5-10 minutos después de que cada objetivo fluye desde la almohadilla de muestra a la almohadilla de mecha. Como se muestra en la Figura 7, la señal apareció en la línea de prueba de la tira cuando se cargó la muestra de esputo después de 10 min. Mientras tanto, no se observó ninguna señal en la línea de prueba de la tira de control, lo que indica la ausencia de cualquier objetivo de la muestra. Los resultados muestran la diana específica del anticuerpo en la línea de prueba cuando no se pudo observar ninguna señal en la línea de prueba cuando se probaron en las tiras la proteína inmunogénica recombinante de M. tuberculosis MPT64 y la albúmina de suero humano. Por lo tanto, el LFIA desarrollado detecta específicamente la muestra de esputo que contiene CFP10-ESAT6 y el anticuerpo en la línea de prueba sólo capta el objetivo específico de la muestra.

Figura 7

Detección específica de la muestra de esputo utilizando LFIA. La detección de CFP10-ESAT6 en la muestra de esputo se observó como un color rojizo en la línea de prueba de las tiras, mientras que no se detectó ninguna señal en la línea de prueba de otro objetivo.

3.4. Estudio de reproducibilidad

El estudio de reproducibilidad de las tiras LFIA desarrolladas se aplicó preparando tres tiras del mismo lote para cada paciente de muestra de esputo clínico. Basándose en la Figura 8, cada muestra de esputo de diferentes pacientes con tuberculosis positiva (1-5) y de pacientes con tuberculosis negativa (6) se probó en las tiras LFIA y los resultados se observaron después de que las muestras de esputo se cargaran en la almohadilla de muestras. Los resultados de cada tira muestran que tanto la línea de prueba como la de control presentan señal después de 5-10 minutos. Por lo tanto, el antígeno CFP10-ESAT6 de M. tuberculosis de la muestra de esputo clínico de pacientes con TB fue detectado por el anticuerpo en cada línea de prueba de las tiras. Estos resultados sugieren que la precisión de cada tira se evaluó eligiendo aleatoriamente el LFIA para la detección de la muestra del analito. Para verificar aún más que el cambio de color se debe a la unión del anticuerpo diana complementario con el anticuerpo de captura en la tira LFIA desarrollada, se empleó una prueba adicional utilizando la muestra de esputo de un paciente negativo para la TB (paciente 6). Después de cargar la muestra en la almohadilla de la tira durante 5-10 minutos, la prueba no mostró ningún cambio de color significativo en la línea de prueba en comparación con la línea de control, lo que sugiere la ausencia de unión no específica del antígeno diana al anticuerpo de captura en la zona de la línea de prueba. Esto demuestra que la detección del color se produjo por la unión del antígeno diana complementario de M. tuberculosis con el anticuerpo funcionalizado en la tira LFIA desarrollada.

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Figura 8

El estudio de reproducibilidad de las tiras de LFIA para la detección del antígeno CFP10-ESAT6 en muestras de esputo de pacientes con TB. (a) Análisis para la muestra de esputo del paciente 1, (b) análisis para la muestra de esputo del paciente 2, (c) análisis para la muestra de esputo del paciente 3, (d) análisis para la muestra de esputo del paciente 4, (e) análisis para la muestra de esputo del paciente 5, y (f) análisis para la muestra de esputo del paciente 6.

4. Conclusiones

Demostramos un método rápido, sencillo y asequible basado en LFIA para un sistema de detección ultrasensible de la TB a simple vista. La detección de CFP10-ESAT6 mediante el procedimiento de formato sándwich presentado en este inmunosensor recién desarrollado muestra una plataforma simple y fácil que puede proporcionar una estrategia alternativa rápida con el potencial de ser utilizada en el diagnóstico de la TB en comparación con el método ELISA. El inmunoensayo en sándwich desarrollado mostró una respuesta de detección excepcional hacia CFP10-ESAT6 en muestras de esputo para la aplicación de muestras clínicas y demostró una alta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad como sensor de base desechable. Este inmunoensayo basado en tiras podría proporcionar un gran potencial en la aplicación de bajo costo y POC para el diagnóstico de la tuberculosis.

Disponibilidad de datos

Los datos utilizados para apoyar las conclusiones de este estudio se incluyen dentro del artículo.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este artículo.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Ministerio de Educación Superior de Malasia y a la Universiti Putra Malaysia el apoyo financiero a través de la Red Universitaria de Investigación de Malasia (MRUN)-Universiti Putra Malaysia (UPM) (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230). También se agradece especialmente a Siti Suraiya de HUSM Kubang Kerian, Kelantan, por ayudar en las pruebas de muestras reales.