Laterální průtoková imunoanalýza pro detekci Mycobacterium tuberculosis pouhým okem
admin - 25 července, 2021Abstrakt
Tuberkulóza (TBC) je infekční onemocnění způsobené Mycobacterium tuberculosis. Zjišťování a kontrola infekčních onemocnění je velkým problémem zejména v rozvojových zemích. Laterální průtoková imunoanalýza (LFIA) byla zavedena jako ruční platforma založená na imunoanalýze v místě péče pro automatizovanou detekci TBC. Antigen CFP10-ESAT6 M. tuberculosis byl použit jako cíl při včasné detekci TBC pomocí strategie POC založené na proužcích LFIA. Zajímavá platforma založená na optických signálech je realizována jako změna barvy v detekční oblasti, která je viditelná pouhým okem. Jako barevná sonda pro detekci zájmového cíle byly použity nanočástice zlata (AuNPs). Obraz z transmisní elektronové mikroskopie s vysokým rozlišením (HRTEM) a analýza ultrafialovým a viditelným spektrofotometrem (UV-Vis) potvrdily, že syntetizované AuNPs jsou vhodné pro navrženou imunoanalýzu. Platforma se skládá z AuNPs konjugovaných se specifickými protilátkami (Ab), které zachycují antigen M. tuberculosis. Pod vlivem kapilárního efektu byly na testovací podložce imunostripu provedeny sendvičové imunoreakce AuNP-Ab-antigen, které lze pozorovat podle barevného signálu na testovací linii stripu s krátkou dobou testu. Nově vyvinutý biosenzor byl dále využit při detekci antigenu CFP10-ESAT6 ve vzorcích lidského sputa s uspokojivými výsledky. Charakteristické barevné proužky umožňují vizuální detekci (pouhým okem) cílového analytu bez přístrojového vybavení. Tento neinvazivní diagnostický systém, který je založen na detekci ve sputu, by mohl poskytnout uživatelsky přívětivé a cenově dostupné diagnostické testy v rozvojových zemích.
1. Úvod
Tuberkulóza (TBC) je jedním z nejsmrtelnějších infekčních onemocnění, které se stalo významným problémem veřejného zdraví na celém světě . Onemocnění je způsobeno především infekcí Mycobacterium tuberculosis, která se může přenášet nepatrnými aerosolovými kapénkami, například kašláním, kýcháním, nebo dokonce mluvením infikované osoby TBC . Toto vzduchem přenosné nakažlivé onemocnění způsobilo ročně více než devět milionů nových případů, čímž se TBC stala druhou nejčastější příčinou úmrtí po infekci virem lidské imunodeficience (HIV) . Mezi hlavní příčiny vysoké míry výskytu TBC patří nedostatečný přístup k účinným diagnostickým metodám a neschopnost včas léčit všechny infekční případy plicní TBC, což umožňuje pokračující přenos M. tuberculosis v rámci komunit.
Současným zlatým standardem pro diagnostiku TBC je mikroskopie výtěru ze sputa, radiologie hrudníku a solidní kultivace . Přestože jsou tyto metody schopny diagnostikovat TBC, jsou tyto testy omezeny nízkou citlivostí, nízkou specificitou a časovou náročností . Byly vyvinuty systémy založené na amplifikaci nukleových kyselin, které nabízejí relativní zlepšení citlivosti, specifičnosti a rychlé detekce M. tuberculosis oproti konvenčním technikám. Tato metoda však vyžaduje vysokou úroveň technické způsobilosti a nákladné vybavení a používá se pouze v zkušených laboratořích, které si mohou dovolit referenční činidla ke sledování výkonnosti testu . Vzhledem k tomu, že tuberkulóza je nemocí chudoby, kdy více než 90 % celosvětové zátěže tuberkulózou se odehrává v zemích s nízkými a středními příjmy, existuje neuspokojená potřeba spolehlivých diagnostických metod pro rychlou, účinnou a přesnou identifikaci onemocnění tuberkulózou, které by byly ekonomicky výhodné pro použití v prostředí s omezenými zdroji.
Papírové imunoanalýzy představují výkonnou techniku s vysokým významem v oblasti biosenzoriky, neboť splňují požadavky potřebné pro zařízení v místě péče (POC), včetně rychlé detekce, malého množství vzorku a nízkých nákladů, takže více lidí může pohodlně získat nákladově efektivní zdravotní péči v oblastech s omezenými zdroji . Imunoanalýzy POC na bázi papíru se obecně skládají ze tří hlavních složek, tj. papíru jako substrátu, protilátek jako detekčního prvku a reportérových molekul jako prvku pro transformaci signálu. Laterální průtoková imunoanalýza (LFIA), známá také jako strip-based biosensing, je jednou ze stávajících platforem na bázi papíru, která představuje nejvýhodnější strategii pro analýzu na místě a jednorázové senzory (na jedno použití) . Stojí za zmínku, že elektrochemické přístupy rovněž využívají výhod proužků s bočním průtokem . LFIA má však některé nevýhody; například při nízkých koncentracích analytu může tato technologie představovat problém z hlediska citlivosti .
Inkorporace nanočástic (NP), jako jsou nanočástice zlata (AuNPs) s různými biorozpoznávacími prvky (protilátky, peptidová pole, polymery a aptamery), představuje účinnou strategii pro zvýšení výkonu detekčních systémů. Papírové biosenzory na bázi AuNP zahájily v poslední době intenzivní studie pro diagnostiku různých infekčních onemocnění, jako je malárie , virus hepatitidy B (HBV) , horečka dengue , virus ebola (EBOV) a další viry. V této souvislosti byly demonstrovány tři typy papírových imunoanalýz, včetně kolorimetrických, fluorescenčních a elektrochemických imunoanalýz. I když imunoanalýzy na bázi fluorescence a elektrochemické imunoanalýzy vykazují pokročilé přednosti, pokud jde o citlivost, jsou s nimi spojeny také problémy vícekrokové operace a závislosti na čtecím zařízení během detekce, což snižuje pohodlí koncových uživatelů. Mezi výhody imunoanalýzy založené na kolorimetrii patří nízká cena, bez nutnosti vybavení, rychlost, čitelnost pouhým okem a vhodnost pro vysoce výkonný screening na místě, nicméně zlepšení přesnosti, citlivosti a kvantifikace jsou stále jejími výzvami .
Pokud jde o ruční detekční platformy pro POC, zejména pro detekci TBC, jeví se jako dobrý začátek LFIA založená na kolorimetrii, protože tato metoda realizovala rychlou diagnostiku v terénních podmínkách a také jednoduchou obsluhu. Kromě toho je včasná detekce tak důležitá, aby bylo možné včas zahájit antituberkulózní léčbu, která je klíčem ke snížení úmrtnosti i k zamezení epidemie TBC. Za tímto účelem jsme se zaměřili na sekreční proteiny M. tuberculosis vhodné pro včasnou detekci TBC. Bylo zjištěno, že 10 kDa protein kultivačního filtrátu (CFP10) a 6 kDa cílový časný sekretovaný antigen (ESAT6) jsou kódovány geny Rv3874, respektive Rv3875. Tyto geny se nacházejí v oblasti difference-1 (RD-1) genomu virulentní M. tuberculosis, což jsou silné antigeny T-buněk rozpoznávané u více než 70 % pacientů s TBC . Vzrušujícím objevem bylo zjištění, že ESAT6 a jeho proteinový partner CFP10 se na sebe těsně vážou v poměru 1 : 1 prostřednictvím hydrofobních a Van der Waalsových interakcí a tvoří proteinový komplex ESAT6-CFP10. Oba proteiny mají v komplexu stabilní, plně složenou strukturu, přičemž přibližně dvě třetiny páteře jsou v pravidelné šroubovicové konformaci . Meher a spolupracovníci uvedli, že tvorba komplexu ESAT6-CFP10 vede ke strukturním změnám, zvýšení termodynamiky a biochemické stability a ztrátě vazby na fosfolipidové membrány . To naznačuje, že ESAT6 a CFP10 jsou aktivní jako komplex a mohou poskytovat několik funkčních výhod, včetně přísnější kontroly aktivity regulačních proteinů, jako jsou transkripční faktory, a obecného mechanismu pro zvýšení specifičnosti interakcí protein-protein a protein-nukleová kyselina . Kromě toho práce, kterou uvedli Renshaw a spolupracovníci, ukázala, že kombinace antigenu CFP10-ESAT6 zvyšuje diagnostický výkon testu ve srovnání s jedním antigenem .
V této práci byly zkombinovány přednosti LFIA a CFP10-ESAT6 jako identifikačního proteinového biomarkeru a poprvé jsme vyvinuli jednorázový testovací proužek na bázi imunoanalýzy jako nový biosenzor pro rychlou detekci TBC pouhým okem. Je pozoruhodné, že strategie, která zahrnovala AuNPs jako značku, hraje klíčovou roli při zvyšování vizuálního efektu a intenzity odezvy LFIA. Konstrukce a princip odezvy této nově vyvinuté metody jsou znázorněny na obrázku 1. Protilátky jsou navázány na různých místech LFIA, aby zachytily cílové antigeny, a barevná detekční činidla značená (AuNPs) na protilátkách dávají barevné odezvy na testovací zóně a kontrolní zóně na LFIA. Charakteristické barevné pásy umožňují vizuální detekci (pouhým okem) cílového analytu. K zesílení detekčního signálu a také ke zvýšení selektivity senzoru vůči biomarkerům specifickým pro TBC byl použit sendvičový formát imunoanalýzy. Výskyt barevné testovací linie i barevné kontrolní linie znamená pozitivní výsledek (obrázek 1(a)), zatímco pozorování jediné barevné kontrolní linie znamená negativní výsledek (obrázek 1(b)). Kontrolní čára indikuje, že vzorek migroval přes membránu tak, jak bylo zamýšleno, bez ohledu na to, zda je analyt ve vzorku přítomen, či nikoli. Pokud se neobjeví vůbec žádná barevná čára, považuje se to za neplatný výsledek; test se proto musí opakovat.
(a)
(b)
(a)
(b)
Prokázali jsme také účinnost vyvinuté LFIA pro detekci CFP10-ESAT6 ve sputu, odebraném z lidských vzorků osob infikovaných TBC. Studie naznačila, že metoda bez krevních testů prostřednictvím detekce biomarkerů ve sputu by mohla mít význam pro včasnou detekci onemocnění TBC, zejména u HIV pozitivních případů, a mohla by tak poskytnout široké potenciální využití v klinické analýze a domácím použití bez nutnosti implementace periferní laboratoře.
2. Materiály a metody
2.1. Materiály a metody
2.2. Metodika a postupy Materiály a činidla
Polyklonální protilátka anti-CFP10, králičí anti-M. tuberculosis, králičí anti-M. tuberculosis HRP konjugát, kozí anti-králičí IgG protilátka, M. tuberculosis ESAT-6-like protein esxB (CFP-10) a rekombinantní M. tuberculosis imunogenní protein MPT64 antigeny byly zakoupeny od společnosti Cusabio (Selangor, Malajsie). Hovězí sérový albumin (BSA), lidské sérum, trihydrát chloridu zlatého (III), uhličitan draselný, tablety fosfátového roztoku (PBS) a Tween-20 byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Substrát ELISA 3,30,5,50-tetramethylbenzidin (TMB) a citrát sodný byly získány od společností Abcam (Cambridge, Spojené království) a R&M Chemicals (Essex, Spojené království). Byly použity vzorky sputa pacientů z Hospital Universiti Sains Malaysia (HUSM), Kelantan, Malajsie, s identifikačními čísly TB1273/2017, B562423, TB541/2016, TB1304/2016, TB1280 a SA217. U vzorku sputa bylo upuštěno od potřeby souhlasu, protože vzorek sputa jsou pouze zbytky vzorků, které byly použity pro laboratorní účely HUSM. Kromě toho byl protokol použitý v této studii schválen Komisí pro lékařský výzkum a etiku (MREC) Ministerstva zdravotnictví Malajsie (číslo schválení: NMRR-17-3001-39473 (IIR)).
2.2. Syntéza zlatých nanočástic
Zlaté nanočástice (AuNPs) byly syntetizovány metodou citrátové redukce, jak bylo uvedeno dříve . Roztok chloridu zlata byl připraven rozpuštěním chloridu zlata ve 100 ml deionizované vody a připravený roztok byl skladován chráněný před světlem. Poté byl před použitím čerstvě připraven roztok citrátu sodného rozpuštěním citrátu sodného ve 100 ml deionizované vody a přefiltrován. Roztok chloridu zlata byl zahříván, dokud roztok nezačal vřít, a citronan sodný byl přidáván po kapkách. Po 10 minutách byla baňka umístěna do vodní lázně, aby se alespoň na 15 minut ochladila. Vzniklé AuNPs byly poté shromážděny a uloženy v chladničce při 4 °C až do dalšího použití. Syntetizované AuNPs byly poté charakterizovány pomocí UV-Vis a HRTEM obrazu.
2.3. Konjugace králičí protilátky proti M. tuberculosis s AuNPs
Konjugace králičí protilátky proti M. tuberculosis s AuNPs byla připravena podle dříve popsaných metod s mírnou modifikací. Stručně řečeno, k 5 ml roztoku koloidního zlata bylo přidáno 6 μl králičí protilátky proti M. tuberculosis (12 μg/ml). Před použitím byla hodnota pH připraveného roztoku AuNP upravena na 8,0 pomocí 0,2 M uhličitanu draselného a 0,1 M HCl. Směs byla míchána 10 min a byl přidán 10% hovězí sérový albumin. Směs byla inkubována po dobu 30 min a uložena přes noc při 4 °C. Poté byla směs centrifugována 10 min při 11 000 g, aby se odstranily nekonjugované protilátky. Peleta byla resuspendována s pasivním ředicím pufrem (PDB) odpovídajícím 1/10 původního objemu. Optická hustota (OD) byla studována pomocí UV-Vis při 540 nm, aby se získala . Nakonec byl roztok konjugované protilátky s AuNP přefiltrován přes 0,45 μm celulózový acetátový filtr.
2.4. Roztok konjugované protilátky s AuNP byl přefiltrován přes 0,45 μm celulózový acetátový filtr. Nanášení testovací a kontrolní linie na nitrocelulosovou membránu
Králičí IgG protilátka byla dávkována na nitrocelulosovou membránu jako kontrolní linie v koncentraci 1 mg/ml. Králičí protilátka proti M. tuberculosis v koncentraci 1 mg/ml byla nanesena na nitrocelulózovou membránu jako testovací linie. Protilátka byla připravena v pufru PBS a 1% sacharóze. Nitrocelulózová membrána byla vysušena při pokojové teplotě a uchovávána při 4 °C.
2.5. Laterální průtokové imunoanalytické proužky
Proužky LFIA byly zakoupeny od společnosti Kestrel Bio Sciences (Thailand) Co., Ltd. (dále jen „Kestrel Bio Sciences“). Konstrukce LFIA je znázorněna na obrázku 2. Proužek LFIA je konstruován se třemi překrývajícími se podložkami umístěnými na podkladové kartě: podložka pro vzorek (Millipore C048, ), membrána (Whatman FF 60/100, ) a stírací podložka (Whatman 470, ). Proužky LFIA byly postupně sestaveny na podkladové kartě s překrytím 1-2 mm. Králičí protilátka proti M. tuberculosis konjugovaná s roztokem AuNP s byla imobilizována na konjugační podložku (0,5 μl na 1 mm). Konjugovaná podložka se sušila 1 h při 37 °C. Poté se na nitrocelulózovou membránu nanesla kozí protilátka proti králičímu IgG a králičí protilátka proti M. tuberculosis, čímž se vytvořila kontrolní linie a testovací linie. Membrány byly sušeny při pokojové teplotě přes noc. Nakonec byly proužky LFIA rozřezány na 4 mm široké proužky a uloženy při 4 °C až do použití.
Vzorky sputa byly zředěny lyzačním pufrem a 100 μl připraveného vzorku bylo naneseno na podložku. Připravené proužky byly umístěny vodorovně po dobu 5 až 10 minut, aby vzorek mohl stékat z podložky pro odběr vzorku na podložku pro odvod vzorku. Byl pozorován výskyt načervenalého zbarvení na zkušební a kontrolní linii.
2.6. Konvenční test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Pro potvrzení pozitivity a negativity vzorků ve srovnání s námi vyvinutým testem LFIA byl proveden semikvantitativní test ELISA. Za tímto účelem byly 96jamkové destičky ELISA potaženy 100 μl králičí protilátky proti M. tuberculosis o koncentraci 1 μg/ml v uhličitanovém pufru. Destička ELISA byla přikryta parafilmem a inkubována po dobu 2 h. Poté byla každá potažená jamka třikrát promyta naplněním jamek promývacím pufrem obsahujícím PBS a Tween-20. Poté byly jamky promyty. Všechny roztoky byly odstraněny 2-3násobným přejetím destičky, aby se odstranil nenavázaný protein. Po promytí byla destička ELISA blokována přidáním 250 μl blokovacího pufru (PBS a BSA) po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Destička ELISA byla opět třikrát promyta promývacím pufrem a do každé jamky bylo přidáno 100 μl různých koncentrací antigenu CFP10-ESAT6 M. tuberculosis v ředicím pufru protilátek obsahujícím PBS, Tween-20 a BSA. Všechny antigeny byly testovány ve třech opakováních a inkubovány přes noc při 4 °C. Po inkubaci antigenu byla destička opět třikrát promyta pomocí promývacího pufru a do každé jamky bylo na 1 h přidáno 100 μl králičího konjugátu anti-M. tuberculosis HRP, následoval promývací krok a přidání substrátového roztoku TMB. Objeví se modré zbarvení, které indikuje přítomnost značené detekční protilátky s komplementární vazbou protilátka-antigen. Nakonec bylo přidáno 100 μl stop roztoku (0,5 M H2SO4) a odečet absorbance byl proveden pomocí ELISA mikrotitrační čtečky.
3. Výsledky a diskuse
3.1. Výsledky a diskuse Ověření sendvičového formátu pomocí konvenčního postupu ELISA
Pro další vysvětlení mechanismu snímání sendvičové strategie a vyhodnocení specifických rolí použitých protilátek byly provedeny kontrolní experimenty. K ověření vazby protilátky a antigenu na testovací linii byla použita analýza ELISA, jak je znázorněno na obrázku 3.
(a)
(b)
(a)
(b)
Detekční protilátka byla značena enzymem HRP, který po přidání TMB vyvolá barevný signál. Byl vytvořen sendvičový komplex ELISA, který zahrnuje záchytnou protilátku, antigen a detekční protilátku (obrázek 3a). Jak je vidět na obrázku 3(a), kontrolní jamka nevykazuje žádný barevný signál, protože nepřítomnost antigenu nezpůsobí vazbu značené detekční protilátky. Destička ELISA vykazuje modrý signál v jamkách s antigenem a v nepřítomnosti antigenu nelze pozorovat žádný modrý signál. Výsledky potvrdily, že fúzní protein CFP10-ESAT6 byl skvělým kandidátním antigenem s vysokou specifitou pro vybrané protilátky použité v této práci na základě sendvičového formátu imunodiagnostiky v ELISA.
Přestože ELISA ukazuje účinnou metodu pro stanovení CFP10-ESAT6 u M. tuberculosis, zdlouhavé promývací postupy a nutné značení protilátek mohou omezit široké využití této metody pro jednoduchou a rychlou detekci TBC. V této studii jsme proto vytvořili jednoduchou, přenosnou, uživatelsky přívětivou a rychlou platformu pro stanovení protilátky anti-CFP10-ESAT6 pro diagnostiku TBC na základě LFIA ve formátu sendvičového testu, jak je znázorněno na obrázku 3b). Použití AuNPs umožňuje pozorování načervenalé barvy. Pozitivní výsledek indikuje pozorování jak barevné testovací linie, tak barevné kontrolní linie, zatímco pozorování jediné barevné kontrolní linie indikuje negativní výsledek. Současné zařízení pro laterální průtok se ukazuje jako slibné pro použití v aplikacích, kde se AuNPs připojují prostřednictvím specifických biologických rozpoznávacích událostí (konfigurace s vazbou na cíl), pokud je přítomen cílový analyt (CFP10-ESAT6).
3.2. Charakterizace protilátky konjugované s nanočásticemi zlata
Syntetizované AuNPs byly charakterizovány pomocí UV-Vis a HRTEM k získání vlnové délky maxima absorbance () a k určení morfologie AuNPs, které byly syntetizovány citrátovou redukční metodou, resp. Na základě obrázku 4(a) částice AuNPs absorbují světlo při absorbanci 520 nm v důsledku povrchové plazmonové rezonance. Obraz HRTEM zobrazený na obrázku 4(b) představuje jasný obraz sférických AuNPs, které jsou navzájem méně agregované, a průměrná velikost získaných AuNPs je přibližně ~30 nm, jak je znázorněno na obrázku 4(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Postup značení AuNP byl použit jako rychlá detekce M. tuberculosis pomocí laterálních průtokových proužků. AuNPs, které byly konjugovány s králičí protilátkou proti M. tuberculosis, byly optimalizovány tak, aby získaly stabilní rubínově červenou barvu pro výskyt jako signál v testovací a kontrolní linii. Stabilita zlatého koloidu byla zkoumána z absorpce koloidu po přidání různých koncentrací protilátky. Optimální stabilizační koncentrace protilátky byla stanovena pomocí různých koncentrací protilátky. Pro konjugaci se protilátky navázaly na povrch AuNP pomocí fyzikálních a chemických interakcí . Protilátka je na AuNP adsorbována nespecificky, zatímco stabilitu v koloidním roztoku zajišťovaly záporně nabité nanočástice . Stabilita koloidu zlata byla zkoumána z absorpce koloidu po přidání různých koncentrací protilátky.
Obrázek 5(a) ukazuje barevné změny roztoku AuNP obsahujícího protilátku o různých koncentracích. Po přidání nízké koncentrace králičí protilátky proti M. tuberculosis v přítomnosti NaCl se barva roztoku změnila z červené na modrou. Při přidání vysoké koncentrace nebo nadměrného množství protilátky zůstává červená barva AuNPs ve stabilním stavu. Minimální koncentrace protilátky pro stabilizaci koloidního zlata byla přibližně 10 μg/ml, jak ukazuje obrázek 5b). Při 10 μg protilátky na 1 ml roztoku zlata byla protilátka dostatečně navázána na AuNPs. Se zvyšující se koncentrací protilátky se na AuNPs vázalo více bílkovin, čímž byla obsazena všechna dostupná vazebná místa. Obrázek 5c) ukazuje UV-Vis absorpční spektra různých koncentrací protilátky konjugované s roztokem AuNP. Maximum absorpce SPR pro roztoky 1 až 8 (od vysokých koncentrací protilátek) se ukazuje přibližně při 550 nm, zatímco roztoky 9 až 11 (nižší koncentrace protilátek) vykazují dlouhý vlnový posun při 570 nm. To je způsobeno agregací AuNPs, která se projevuje v roztocích 9 až 11.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. UV-Vis pík AuNPs inkubovaných s různými koncentracemi protilátek. Charakterizace imunoanalýzy s bočním průtokem pro detekci antigenu a protilátky proti tuberkulóze
Testovací proužky byly zkonstruovány, jak je znázorněno na obrázku 6. Proužek obsahuje tři hlavní prvky: konjugovanou podložku, membránu a absorpční podložku. Membrána Whatman byla použita tak, aby tok vzorku probíhal hladce. Vzorek ze vzorkovací podložky protéká přes konjugovanou podložku až k absorpční podložce. Odváděcí podložka přetáhla vzorek přes zkušební a kontrolní linie tím, že zachytila přebytečný vzorek. Protilátka konjugovaná s AuNPs byla nanesena na konjugovanou podložku. Králičí anti-M. tuberculosis byla zarovnána na membránu, která byla známa jako testovací linie. Druhá linie byla zarovnána kozí protilátkou proti králičímu IgG a byla známa jako kontrolní linie. Protilátka na testovací linii zachytí antigen, který byl navázán na protilátku označenou AuNPs. V důsledku toho bylo možné na testovací linii pozorovat načervenalou barvu signálu. Protilátka králičího IgG na kontrolní linii zachytí zbývající protilátku značenou AuNP a může vždy vykazovat signál jako validační test.
(a)
(b)
(a)
(b)
Kontrolní linie na nitrocelulózové membráně byla optimalizována tak, aby byl pouhým okem pozorovatelný jasný červený signál. Testovací proužky byly testovány lyzačním pufrem (bez antigenu) a pufr byl ponechán na nitrocelulózové membráně, aby protékal bokem. Červenavý signál na kontrolním řádku lze pozorovat pouhým okem, jak je znázorněno na obrázku 6a) po 5 až 10minutovém zatížení pufrem. Po otestování proužků s laterálním průtokem s klinickým vzorkem pacientů s pozitivní TBC bylo na podložku se vzorkem nadávkováno 100 μl roztoku. Jak ukazuje obrázek 6(b), na testovací a kontrolní linii bylo možné pozorovat načervenalý signál. Tento výsledek naznačuje, že protilátka na testovací linii se úspěšně navázala na antigen CFP10-ESAT6 ve vzorku sputa.
Vyvinutá LFIA byla dále testována s různými typy antigenů, aby se ověřila specifita proužků. Testovací linie každého proužku, která byla tečkovaná s protilátkou, byla pozorována po 5-10 minutách poté, co každý terčík přetekl z podložky se vzorkem na stírací podložku. Jak ukazuje obrázek 7, signál se objevil na testovací linii proužku, když byl vzorek sputa načten po 10 min. Mezitím nebyl na testovací linii kontrolního proužku pozorován žádný signál, což naznačuje nepřítomnost jakéhokoli cíle vzorku. Výsledky ukazují specifický cíl protilátky na testovací linii, když při testování rekombinantního imunogenního proteinu M. tuberculosis antigenu MPT64 a lidského sérového albuminu na proužcích nebyl na testovací linii vidět žádný signál. Vyvinutá LFIA tedy specificky detekuje vzorek sputa, který obsahuje CFP10-ESAT6, a protilátka na testovací linii zachycuje pouze specifický cíl vzorku.
3.4. Studie reprodukovatelnosti
Studie reprodukovatelnosti vyvinutých proužků LFIA byla aplikována přípravou tří proužků ze stejné šarže pro každého pacienta s klinickým vzorkem sputa. Na základě obrázku 8 byl každý vzorek sputa od různých TBC pozitivních pacientů (1-5) a TBC negativních pacientů (6) testován na proužcích LFIA a výsledky byly pozorovány po načtení vzorků sputa na vzorkovací podložku. Výsledky na každém proužku ukazují, že testovací i kontrolní linie vykazují signál po 5 až 10 minutách. Antigen CFP10-ESAT6 M. tuberculosis z klinického vzorku sputa pacientů s TBC byl tedy detekován protilátkou na každé testovací linii proužků. Tyto výsledky naznačují, že přesnost každého proužku byla hodnocena náhodným výběrem LFIA pro detekci analytu vzorku. K dalšímu ověření, že změna barvy je způsobena navázáním komplementární cílové protilátky na záchytnou protilátku na vyvinutém proužku LFIA, byl použit doplňkový test s použitím vzorku sputa od pacienta negativního na TBC (pacient 6). Po naložení vzorku na podložku proužku na 5 až 10 minut test nevykázal žádnou významnou barevnou změnu na testovací linii ve srovnání s kontrolní linií, což naznačuje nepřítomnost nespecifické vazby cílového antigenu na záchytnou protilátku na zóně testovací linie. To dokazuje, že k barevné detekci došlo navázáním komplementárního cílového antigenu M. tuberculosis s protilátkou funkcionalizovanou na vyvinutém proužku LFIA.
(a)
(b)
(c)
.
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Závěry
Demonstrovali jsme rychlou, jednoduchou a cenově dostupnou metodu založenou na LFIA pro ultrasenzitivní systém detekce TBC pouhým okem. Detekce CFP10-ESAT6 pomocí postupu sendvičového formátu představeného v tomto nově vyvinutém imunosenzoru ukazuje jednoduchou a snadnou platformu, která může poskytnout rychlou alternativní strategii s potenciálem využití v diagnostice TBC ve srovnání s metodou ELISA. Vyvinutá sendvičová imunoanalýza prokázala výjimečnou detekční odezvu vůči CFP10-ESAT6 ve vzorku sputa pro klinické použití a prokázala vysokou citlivost, specifičnost a reprodukovatelnost jako senzor na jedno použití. Tato proužková imunoanalýza by mohla poskytnout velký potenciál v nízkonákladové a POC aplikaci pro diagnostiku TBC.
Data Availability
Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou součástí článku.
Conflicts of Interest
Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke střetu zájmů.
Poděkování
Autoři by rádi poděkovali Ministerstvu vysokého školství Malajsie a Universiti Putra Malaysia za finanční podporu prostřednictvím Malaysia Research University Network (MRUN)-Universiti Putra Malaysia (UPM) (UPM/800-4/11/MRUN/2018/5539230). Zvláštní poděkování patří také Siti Suraiya z HUSM Kubang Kerian, Kelantan, za pomoc při testování reálných vzorků
.
Napsat komentář